乳腺癌間質(zhì)T細(xì)胞亞群與乳腺癌5年生存率相關(guān)性的研究

姚 宇，陳登庭，邢魯奇，鄧 淼

乳腺癌是威脅人類(lèi)健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一。惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，尤其是T細(xì)胞各亞群的數(shù)量及其功能狀態(tài)密切相關(guān)[1]，近年來(lái)很多研究表明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells ,Tregs)在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮免疫抑制作用。本研究采用免疫組化方法檢測(cè)腫瘤局部T淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)狀況，及其與乳腺癌臨床病理特征相關(guān)性，探討其對(duì)乳腺癌患者5 a生存率的影響。

1 材料與方法

1.1檢測(cè)對(duì)象選取河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2001～2006年乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌病例80例，常規(guī)術(shù)后甲醛固定石蠟包埋。均為女性，年齡29～73歲，平均45.0歲。按2003年美國(guó)腫瘤聯(lián)合會(huì)(AJCC)乳腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期2例，Ⅱ期59例，Ⅲ期16例，Ⅳ期3例；組織學(xué)分級(jí):高分化9例，中分化60例，低分化11例；手術(shù)病理證實(shí)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例；所有患者均進(jìn)行了術(shù)后5 a隨訪，隨訪結(jié)果：死亡11例，存活69例，5 a生存率為86.3%。所有患者術(shù)前均未接受放、化療，全部標(biāo)本HE染色后均經(jīng)兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師診斷。

1.2檢測(cè)方法所有標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為4 μm，每例標(biāo)本切4張,染色時(shí)用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。小鼠抗人CD4單克隆抗體和小鼠抗人CD8單克隆抗體為即用型試劑，(福州邁新生物技術(shù)有限公司)；兔抗人FoxP3多克隆抗體(博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))，染色結(jié)果用DAB顯色。

1.3結(jié)果判定FoxP3：陽(yáng)性細(xì)胞著色定位于胞漿，CD4+和CD8+細(xì)胞著色定位于細(xì)胞膜，表現(xiàn)為淺黃、棕黃或棕褐色。用雙盲半定量法評(píng)估其染色，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為(-)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞數(shù)<25%為(+)，25%～50%為(++)，>50%為(+++)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均用SPSS 11.5 for Windows軟件包處理，按不同臨床病理指標(biāo)進(jìn)行分組，生存率用Kaplan-Meier方法計(jì)算；各組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1乳腺癌間質(zhì)T細(xì)胞亞群與患者5a生存率的相關(guān)性用Kaplan-Meier方法計(jì)算，F(xiàn)oxp3+Tregs陽(yáng)性組和陰性組5 a生存率分別為92.5%和83.0%，兩者比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)；CD4+T細(xì)胞陽(yáng)性組和陰性組5 a生存率分別為73.7%和64.3%，兩者比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)；CD8+T細(xì)胞陽(yáng)性組和陰性組5 a生存率分別為25.0%和38.8%，兩者比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 乳腺癌間質(zhì)T細(xì)胞亞群活性與5 a生存率的相關(guān)性

2.2乳腺癌間質(zhì)Foxp3+Tregs浸潤(rùn)與患者臨床病理特征的關(guān)系乳腺癌間質(zhì)中Foxp3+Tregs浸潤(rùn)與pTNM分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有顯著性差異(P<0.05)，與年齡、腫瘤大小無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 乳腺癌間質(zhì)Foxp3+Tregs的浸潤(rùn)

2.3乳腺癌間質(zhì)CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)與患者臨床病理特征的關(guān)系乳腺癌間質(zhì)中CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)與pTNM分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有顯著性差異(P<0.05)，與年齡、腫瘤大小無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)表3。

2.4乳腺癌間質(zhì)CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)與患者臨床病理特征的關(guān)系腺癌間質(zhì)中CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)與pTNM分期、組織學(xué)分級(jí)均有顯著性差異(P<0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡、腫瘤大小無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表3 乳腺癌間質(zhì)CD4+T細(xì)胞的浸潤(rùn)

表4 乳腺癌間質(zhì)CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)

3 討論

在腫瘤局部微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞相互誘導(dǎo)，相互抑制，若T細(xì)胞各亞群之間比例關(guān)系及功能出現(xiàn)異常，微環(huán)境內(nèi)免疫功能會(huì)受到抑制，最終將導(dǎo)致機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫無(wú)能和腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[2]。這其中涉及多種調(diào)控因素，近幾年研究較多的是具有免疫負(fù)性調(diào)節(jié)作用的Tregs,表達(dá)在其胞核的叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/winged helix transcription factor p3, Foxp3)在2001年由Brunkown等首次報(bào)道，目前被認(rèn)為是Tregs最具特異性的標(biāo)記物，且其在調(diào)節(jié)Tregs發(fā)育和功能方面起決定性的作用,是T淋巴細(xì)胞向免疫抑制功能定向分化的關(guān)鍵因素[3]。

T細(xì)胞是機(jī)體抵御腫瘤的主要力量，其中CD8+T細(xì)胞直接作為效應(yīng)細(xì)胞特異性殺傷癌細(xì)胞， CD4+T細(xì)胞主要通過(guò)分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)機(jī)體抗腫瘤免疫狀態(tài)，二者皆處于免疫系統(tǒng)與腫瘤相互作用的前沿，若出現(xiàn)異常會(huì)直接影響機(jī)體抵御腫瘤的能力[4]。本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌間質(zhì)中Foxp3+Tregs的浸潤(rùn)與組織學(xué)分化異常程度、pTNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的程度呈正相關(guān)，而CD4+及 CD8+T細(xì)胞在乳腺癌間質(zhì)的浸潤(rùn)與這些臨床病理特征呈負(fù)相關(guān)，但這些腫瘤間質(zhì)T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)與患者的年齡和腫瘤大小無(wú)相關(guān)性?？商崾救橄侔╅g質(zhì)Foxp3+Tregs可促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，在患者病情進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮積極作用，它的增多可能抑制了在機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要功能的CD4+和CD8+T細(xì)胞，打破腫瘤間質(zhì)免疫平衡狀態(tài)，致使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，從而參與腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。Liyanage等對(duì)胰腺癌腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞和局部淋巴結(jié)中Treg細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞數(shù)量在腫瘤局部顯著增多[5]。有研究表明，在卵巢癌患者中發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞可抑制CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及NK細(xì)胞的抗瘤活性。有學(xué)者認(rèn)為，F(xiàn)oxp3+Tregs可通過(guò)多種途徑抑制間質(zhì)T細(xì)胞亞群的免疫功能，通過(guò)抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞IL-2基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)來(lái)抑制T淋巴細(xì)胞的活化、增殖[6]，亦能通過(guò)下調(diào)樹(shù)突狀細(xì)胞的CD80和CD86共同刺激分子表達(dá)、抑制樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和上調(diào)穿孔素和顆粒酶的表達(dá)，有選擇性地殺傷提呈抗原的B細(xì)胞，抑制B細(xì)胞的增殖，從而影響抗原的提呈，致使腫瘤局部免疫無(wú)能，腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，患者病情加重出現(xiàn)腫瘤擴(kuò)散甚至轉(zhuǎn)移[7-8]。這些論斷與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，提示Foxp3+Tregs在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可以作為評(píng)估患者病情程度的一個(gè)參考指標(biāo)或者是治療中的一個(gè)針對(duì)點(diǎn)。本研究還發(fā)現(xiàn)，5 a存活陰性組患者的腫瘤間質(zhì)T淋巴細(xì)胞亞群與5 a存活陽(yáng)性組患者的相比較,差異并無(wú)顯著性，這提示了雖然乳腺癌間質(zhì)T淋巴細(xì)胞亞群平衡狀態(tài)的改變使得腫瘤間質(zhì)出現(xiàn)免疫抑制，造成腫瘤細(xì)胞對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的耐受和免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)進(jìn)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但與乳腺癌患者5 a生存并無(wú)明顯相關(guān)性。對(duì)于這一研究結(jié)果，我們可認(rèn)為，對(duì)乳腺癌患者預(yù)后有影響的因素有多種，間質(zhì)T細(xì)胞亞群只是對(duì)其有重要影響的因素之一，故還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和研究。

近年來(lái)，免疫治療腫瘤已成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)之一，一些腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞過(guò)繼免疫治療和腫瘤疫苗已通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)，但效果并不理想，其中有很多需要解決的問(wèn)題[9-10]。本研究提示，乳腺癌間質(zhì)T細(xì)胞亞群與腫瘤細(xì)胞的相互影響、相互抑制直接關(guān)系著患者病情的發(fā)展，對(duì)間質(zhì)T細(xì)胞亞群的研究，或許可以為對(duì)抗惡性腫瘤提供新的途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1]Zltlne HD．Immunology[M]．Philadelphia：WB Saunders Co，2001，35(7):129-135．

[2]奚桂林.CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞研究[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊(cè)，2004，27(3):141-145.

[3]Brunkow ME,Jeffery EW,Hjerrild KA,et al.Disruption of a new forkhead/winged-helix protein scurfin results in the lymphoproliferative disorder of the scurfy mouse [J].Nat Genet, 2001, 27(1):68-73.

[4]Beyer M.Regulatory T cells in cancer[J].Blood,2006,,108(3): 804-811.

[5]Nishikawa H，Kato T，Tawara I，et a1．IFN-gamma controls the generation/activation of CD4+CD25+regulatory T cells in antitumor immune response[J].Immune，2005，175(7)：4433-4440．

[6]Liyanage Uk，Moore TT，Joo HG，et al.Prevalence of regulatory T cells is increased in peripheral blood and tumor microenviroment of patients with pancreas or breast adenocarcinomal [J]．J Immunal，2002，169(5)：2756-2761．

[7]Sakaguchi S,Yamaguchi T ,Nomura T,et al.Regulatory T cells and immune tolerance[J].Cell,2008,133:775-787.

[8]Cao X,Cai SF,Fehniger TA,et al .Granzyme B and Perforin Are Important for Regulatory T Cell-Mediated Suppression of Tumor Clearance [J].Immunity , 2007, 27 :635-646.

[9]何生，巴明臣，章崇杰，等．腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞及重組白細(xì)胞介素2治療原發(fā)性肝細(xì)胞癌[J]．中國(guó)普通外科雜志，1999,(2):85-88.

[10] Sutmuller RP,Van LM,Duivenvoorde A,et al.Synergism of cytotoxic T Lymphocyte-associated antigen 4 blockade and depletion of CD25+Regulatory T cells in antitumor therapy reveals alternative pathways for suppression of autoreactive cytotoxic T Lymphocyte response [J].J Exp Med,2001,194(6):823-829.