5種旋毛蟲肌肉幼蟲囊包玻片標(biāo)本制作方法的比較

劉潤芳，張小娟，王新彩，祝曉瑩

旋毛形線蟲簡稱旋毛蟲(Trichinella spiralis)，其成蟲寄生在宿主的十二指腸和空腸上段，幼蟲寄生在同一宿主的橫紋肌細(xì)胞內(nèi)，引起的旋毛蟲病是一種重要的人畜共患寄生蟲病。人食入含有活幼蟲囊包的肉類及其制品而感染，從病人肌肉組織中查到旋毛蟲幼蟲囊包是最準(zhǔn)確的診斷方法[1]。因此尋找快速、簡便、有效的旋毛蟲肌肉幼蟲囊包標(biāo)本制作方法對旋毛蟲病的診斷和人體寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)具有重要意義。 本文在對酸性和堿性溶液的濃度、溶液中染色劑的含量進(jìn)行調(diào)整的基礎(chǔ)上，采用不同濃度的醋酸卡紅、明礬卡紅、不染色5種方法對旋毛蟲肌肉幼蟲囊包進(jìn)行染色觀察比較。結(jié)果顯示，10%醋酸卡紅染色法或?qū)?5%醋酸卡紅原液稀釋100倍對標(biāo)本染色，均取得理想的染色效果。所以旋毛蟲肌肉幼蟲囊包永久性玻片標(biāo)本的制作可采用這兩種染色方法。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源旋毛蟲陽性鼠由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室王忠全教授、崔晶教授惠贈。SPF小鼠購于河南省實(shí)驗(yàn)動物中心。將24只雌性小鼠隨即分為4組，每組6只，取含有旋毛蟲幼蟲的小鼠肌肉壓片計數(shù)，每組分別喂飼的旋毛蟲幼蟲數(shù)為50條/只，100條/只，150條/只、200條/只。在感染后45 d將小鼠斷髓處死，取咬肌、膈肌、舌肌、腹肌、肋間肌、前腿肌、后腿肌壓片，在顯微鏡下觀察旋毛蟲囊包和囊內(nèi)幼蟲的形態(tài)[2，3]。

1.2標(biāo)本固定將顯微鏡下觀察到的含有旋毛蟲幼蟲囊包的小鼠肌肉壓片用棉線捆扎，置于70%酒精固定48 h。

1.3染色

1.3.110%醋酸卡紅染液(方法1) 用蒸餾水將方法2的染液稀釋1倍，分色時間延長至35 min。其他方法同方法3。

1.3.220%醋酸卡紅染液(方法2) 配制染液時，將1 g卡紅加于冰醋酸20 mL和蒸餾水80 mL中，煮沸、過濾，直接用于標(biāo)本染色。分色時間延長至20 min。其他操作步驟同方法3。

1.3.345%醋酸卡紅染液原液稀釋100倍染色(方法3) ①染色：將5 g卡紅加于冰醋酸45 mL和蒸餾水55 mL中，酒精燈加熱煮沸，過濾，密封保存。使用時取1份原液加99份蒸餾水稀釋，自酒精固定液內(nèi)取出標(biāo)本，打開玻片，用手術(shù)刀片將肌肉小心刮下，在70%酒精中洗5 min，放入稀釋后的染液內(nèi)染色，染色時間18～24 h。②分色：2%鹽酸酒精分色2～3 min,70%酒精洗滌2次，每次2～3 min。③脫水：將肌肉標(biāo)本依次放入80%、95%、95%、100%乙醇中脫水各30 min。④透明：將標(biāo)本放入純酒精和二甲苯各50%的混合液中透明30 min，取出，放入純二甲苯透明30 min。⑤封片：用鑷子夾取肌肉標(biāo)本置于潔凈載玻片右側(cè)約1/3處，輕壓使肌肉標(biāo)本平整，在肌肉標(biāo)本處滴適量加拿大樹膠，加蓋玻片封片。

1.3.4明礬卡紅染色(方法4) ①染液配制：將1.5 g卡紅溶于3%鉀明礬水溶液中，煮沸15 min，輕輕攪拌使卡紅充分溶解，冷卻、過濾，加入幾滴甲醛。②染色：將保存于70%酒精的肌肉標(biāo)本依次浸入60%、50%、40%、30%酒精中逐漸退至蒸餾水中，每次30 min。將旋毛蟲肌肉標(biāo)本浸于明礬卡紅標(biāo)本中過夜。③分色：將標(biāo)本自染色液中取出，用蒸餾水換洗2次，每次20 min，然后用2%鉀明礬水溶液分色30 min。④將肌肉標(biāo)本依次放入30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇中脫水各30 min。⑤透明：將標(biāo)本放入環(huán)保透明劑透明，隔夜。⑥封片：用鑷子夾取肌肉標(biāo)本置于潔凈載玻片右側(cè)約1/3處，輕壓使肌肉標(biāo)本平整，在肌肉標(biāo)本處滴適量加拿大樹膠，加蓋玻片封片。

1.3.5不染色標(biāo)本的制作(方法5) 將70%酒精固定好的肌肉標(biāo)本放入培養(yǎng)皿，加入純酒精和二甲苯各50%的混合液中透明30 min，取出，放入純二甲苯透明30 min，加拿大樹膠封片。

2 結(jié)果

2.1方法1制作的標(biāo)本(圖1A) 在光學(xué)顯微鏡下觀察，標(biāo)本顏色極淺，接近不染色標(biāo)本，肌纖維不太明顯，囊包輪廓清晰，囊內(nèi)幼蟲立體感強(qiáng)，清楚可辨。

2.2方法2制作的標(biāo)本(圖1B) 標(biāo)本被染成深紅色，囊包與肌纖維界限清晰，囊內(nèi)幼蟲著色較深，標(biāo)本不甚透明。

2.3方法3制作的標(biāo)本(圖1C) 標(biāo)本肌肉呈淡紫紅色，囊內(nèi)幼蟲淡紅色，囊包壁顏色較淺，囊包與肌肉組織界限分明，標(biāo)本透明度較好。

2.4方法4制作的標(biāo)本(圖1D) 標(biāo)本肌肉組織被染成淡紫色，囊包和囊內(nèi)幼蟲呈較深的紫色，囊包和肌纖維輪廓清晰，囊內(nèi)幼蟲立體感欠佳。

2.5不染色標(biāo)本(圖1E) 囊包界限尚可，囊內(nèi)幼蟲欠清晰。

A：方法1制作的標(biāo)本；B：方法2制作的標(biāo)本；C：方法3制作的標(biāo)本；D：方法4制作的標(biāo)本；E：方法5制作的標(biāo)本

3 討論

旋毛蟲肌肉幼蟲囊包永久性玻片標(biāo)本的制作方法有多種，但標(biāo)本的制作效果和溶液的種類、濃度，所采用染料的種類及其在溶液中的含量，染色過程中各個步驟時間的控制均有很大關(guān)系[4，5]?？t是從昆蟲胭脂蟲中提煉出來的一種粉末狀染料，可溶解于酸性或堿性溶液中。醋酸卡紅適宜于小型標(biāo)本的染色，滲透作用快,兼有殺死固定作用,且染色標(biāo)本不易褪色[6，7]。本次采用醋酸卡紅制作標(biāo)本過程中，45%的醋酸卡紅原液(含卡紅5 g)稀釋100倍、10%的醋酸卡紅染液(含卡紅0.5 g)制作的標(biāo)本囊包輪廓清晰，囊內(nèi)幼蟲卷曲自然清晰、立體感強(qiáng)，效果較佳。只是前者稀釋倍數(shù)較大，染色較淡，所以適當(dāng)降低原液的稀釋倍數(shù)可取得理想的染色效果。20%的醋酸卡紅(含卡紅1 g)染液，溶液較濃，染色過深，雖延長分色時間至40 min仍不能取得滿意染色效果。明礬卡紅染色力較弱，適合小型標(biāo)本的染色，沒有濃染之弊。在采用明礬卡紅染液染色過程中，作者用烷烴化合物類環(huán)保透明劑代替二甲苯進(jìn)行標(biāo)本的透明，結(jié)果標(biāo)本染色濃淡適中，囊包和肌纖維輪廓清晰，不足之處是囊內(nèi)幼蟲立體感欠佳。由于二甲苯屬于中度毒性的化學(xué)試劑，長期使用可對機(jī)體構(gòu)成危害[8，9]，所以，近幾年有人用環(huán)保透明劑替代二甲苯用于病理組織切片的制片過程[10]，但將環(huán)保透明劑應(yīng)用于寄生蟲標(biāo)本制作尚未見報道。寄生蟲標(biāo)本的制作過程與病理組織切片的制作有不同之處，旋毛蟲肌肉幼蟲囊包標(biāo)本采用的是肌肉組織壓片而非石蠟切片，所以對標(biāo)本的透明時間的長短、是否會造成蟲體和組織的破壞、標(biāo)本的長期封固效果均有待進(jìn)一步觀察。

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