不同產(chǎn)地火棘果實黃酮體外抗氧化作用

李 偉，程 超

(湖北民族學院 生物科學與技術學院，湖北 恩施445000)

火棘(Pyracantha fortuneana(Maxim．)Li)為薔薇科蘋果亞科火棘屬常綠野生灌木果樹植物，產(chǎn)區(qū)均可以果實代替糧食．火棘屬植物主要分布在我國西南地區(qū)，以湖北、四川、貴州等省產(chǎn)量較大［1－2］．

有關火棘的研究重點在火棘的組織培養(yǎng)、觀賞園藝及功能作用方面［3－4］，同時前期研究發(fā)現(xiàn)火棘果黃酮具有很強的抗氧化效果［5］，但目前對恩施州不同地區(qū)火棘功效成分及功能作用的研究較少研究報道． 因此本文主要以湖北省恩施州不同海拔地區(qū)、不同成熟期的火棘果實中的黃酮為分析指標，對其進行初步分離純化，并對不同產(chǎn)區(qū)的黃酮的抗氧化作用進行了研究，期望本研究可為火棘優(yōu)良種質(zhì)的選育方面提供新的信息資料．

1 材料與方法

1．1 試驗材料

火棘果實:試驗材料共有6 種，如表1 所示． 以下編號代表種類與此相同．

表1 火棘果原料產(chǎn)地及特征Tab．1 The place and characteristics of raw materials from Pyracantha fortuneana Fruits

1．2 試驗試劑

蘆丁標準品(上海研生實業(yè)有限公司);DPPH(上?；瘜W工業(yè)發(fā)展有限公司);AB－8、D－101、NKA－II 型大孔樹脂(天津歐瑞生物科技有限公司)．

乙醇、石油醚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、濃硫酸、苯酚、濃鹽酸、沒食子酸、三烴甲基氨基甲烷，均為國藥集團化學試劑有限公司，分析純．

1．3 試驗儀器

DL－5 低速大容量離心機(上海安亭科學儀器廠);RE－52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);DHL－A電腦恒流泵(上海滬西分析儀器廠);TH－1000 梯度混合器(上海滬西分析儀器廠);層析柱:1．6×50 cm(上海滬西分析儀器廠);DBS－100 電腦全自動部分收集器(上海滬西分析儀器廠);756MC 紫外可見光分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)．

1．4 試驗方法

1．4．1 火棘果黃酮提取工藝流程 參照文獻［6］，略有修改，準確稱取10 g 原料，按料液比1 ∶5 加入石油醚，回流脫色脫脂1 h，4 800 r/min 離心15 min，收集沉淀自然干燥，將干燥粉末用1 ∶25 料液比在80℃下用90%乙醇溶液回流提取3 h，4 800 r/min 離心15 min，取上清液濃縮后冷凍干燥即可．

1．4．2 黃酮含量測定 分別吸取0．5 mg/mL 蘆丁標準溶液0、0．4、0．8、1．2、1．6、2．0 mL 于10 mL 容量瓶中，加5% NaNO2溶液0． 3mL，放置6 min，再加10%Al(NO3)3溶液0．3 mL，放置6 min，加4%NaOH 溶液4．0 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，于510 nm 測吸光度［7］．以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線并得線形回歸方程為y=－0．004 9+1．072 1x，R2=0．999 6．

其中:V:黃酮溶液總體積(mL);W:火棘果黃酮重量(g)．

1．4．3 黃酮的分離純化

1．4．3．1 大孔樹脂預處理 分別稱取10 g AB－8、D－101、NKA－Ⅱ型大孔樹脂，用95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹后，抽濾，蒸餾水反復沖洗至中性;再用5% NaOH 浸泡3 h，再用蒸餾水洗至中性;用5% HCL 溶液浸泡3 h，再用蒸餾水洗滌至中性備用［8－9］．

1．4．3．2 大孔樹脂篩選 稱取1．0 g 經(jīng)處理好的樹脂于50 mL 燒杯，加入質(zhì)量體積分數(shù)為C0的黃酮提取液10 mL，室溫攪拌2 h，4 800 r/min 離心15 min，得上清液1，測其黃酮質(zhì)量體積分數(shù)為C1．取出吸附飽和的樹脂加入10 mL 體積分數(shù)為90%乙醇洗脫，同樣溫度下攪拌2 h，離心，得上清液2，測其黃酮質(zhì)量體積分數(shù)C2，分別以吸附率和解吸率為參考指標進行樹脂優(yōu)化［8－9］．

式中:C0為黃酮提取液質(zhì)量體積分數(shù)，mg/mL;C1為樹脂吸附后剩余溶液質(zhì)量體積分數(shù)，mg/mL;C2為洗脫液質(zhì)量體積分數(shù)，mg/mL;V為加入黃酮體積;V1為上清液1 的體積;V2為上清液2 的體積．

1．4．3．3 飽和吸附量的確定 將一定量大孔樹脂裝柱，以0．61 mg/mL 黃酮液上柱，流速1．5 mL/min，收集流出液，測定流出液體積及吸光度．直至流出液吸光度與黃酮原溶液吸光度一樣時，即達到飽和吸附量，停止上柱．

1．4．3．4 洗脫劑質(zhì)量體積分數(shù)的確定 先用蒸餾水洗脫，洗去大孔樹脂吸附的多糖(取1 mL 蒸餾水洗脫液按苯酚－硫酸法檢測多糖，至顏色變?yōu)闊o色時停止蒸餾水洗脫)，而后依次用50 mL 30%、50%、70%、90%乙醇溶液洗脫，收集不同質(zhì)量體積分數(shù)乙醇洗脫液，測定黃酮質(zhì)量體積分數(shù)，以確定最佳洗脫劑．

1．4．3．5 黃酮純?nèi)芤旱氖占?在層析柱中加入一定量樹脂，加入一定量(能使樹脂達到飽和吸附狀態(tài))提取液，只至達到飽和吸附，先用蒸餾水洗脫多糖類物質(zhì)，接著用乙醇洗脫，并收集前30 管，每管5 mL，流速為1．5 mL/min．收集后，分別取0．5 mL 收集液測其吸光值．

1．4．4 不同產(chǎn)地火棘果黃酮提取液及黃酮純化后的抗氧化作用研究

1．4．4．1 對DPPH 自由基的清除作用 在試管中依次加入2．5 mL 6．5×10－5mol/L DPPH 和1．5 mL 60%乙醇，總體積4．0 mL，混合20 min 后，于1 cm 比色皿測定517 nm 吸光度記為A0;加入2．5 mL 6．5×10－5mol/L DPPH 再加入各梯度提取液，即5、10、15、20、25 μg/mL 黃酮提取液，最后加入60%乙醇至4．0 mL 測定A517nm記為Ai;加入2．5 mL60%乙醇和各梯度待測液，各加60%乙醇至4．0 mL，測定A517nm記為Aj;按下列公式計算DPPH自由基清除率［10］．

1．4．4．2 對超氧自由基清除率的測定 采用鄰苯三酚自氧化法測定，取4．5 mL pH 8．23 50 mmol/L Tris－HCl 緩沖液、4．2 mL 蒸餾水，混勻后室溫保持20 min，取出后立即加入3 mmol/L 鄰苯三酚(以10 mmol/L HCl配制，空白管用10 mmol/L HCl 代替鄰苯三酚溶液)0．3 mL，迅速搖勻后，在325 nm 下每隔30 s 測定吸光度．加入鄰苯三酚前，先加入一定體積黃酮溶液，蒸餾水減少，再按下述方法計算抑制率［11］．抑制率計算公式:

式中:△A0為鄰苯三酚的自氧化速率，△A為加入黃酮溶液后鄰苯三酚的自氧化速率，單位均勻為吸光度每分鐘的增值．

2 結果與分析

2．1 不同產(chǎn)地火棘果中黃酮含量測定結果

分別對6 種原料的火棘果實中的黃酮含量進行測定，重復3 次，具體結果見圖1．

圖1 不同產(chǎn)地火棘果黃酮含量Fig．1 The flavonoide quantity of different kinds of Pyracantha fortuneana fruits

由圖1 可以看出，不同產(chǎn)地火棘果黃酮含量差異顯著，尤其是C3 黃酮含量最高，其次是C2，這可能是由于成熟期對黃酮含量有影響．

2．2 火棘果黃酮的分離純化

2．2．1 大孔樹脂的篩選 試驗選擇黃酮含量最高的宣恩曉關的火棘果為原料研究其純化工藝，具體結果見表2．大孔樹脂由于其理化性質(zhì)不同對黃酮的吸附及解吸影響很大，樹脂的極性、孔徑、比表面積、孔容等均能影響其吸附率．從表2 可以看出，AB－8 對黃酮的吸附能力相對較強，解析率也相對較高，相同條件下AB－8 型大孔樹脂解吸出來的黃酮量較多，故選擇AB－8 型大孔樹脂為分離純化火棘果黃酮樹脂．

表2 3 種大孔樹脂對火棘果黃酮吸附及解吸性能比較Tab．2 Comparison of adsorption and desorption of three types macroporous resin on Pyracantha fortuneana fruit flavonoid

2．2．2 飽和吸附量確定 按照試驗方法1．4．3．3 進行樹脂飽和吸附量的確定，以黃酮溶液的上樣體積為橫坐標，流出液的吸光度值為橫坐標繪制飽和吸附量曲線，具體結果見圖2．

圖2 AB－8 型大孔樹脂對黃酮的動態(tài)吸附能力Fig．2 Dynamic adsorption capability of AB－8 macroporous resins on flavonoid

由圖2 可知，AB－8 型大孔樹脂對黃酮的吸附達到飽和時的上樣體積約為80 mL，即樹脂吸附的黃酮總量為16．161 mg，吸附量為0．946 mg 黃酮/mL 樹脂．

2．2．3 洗脫劑質(zhì)量體積分數(shù)的優(yōu)化 火棘果黃酮溶液中含有水溶性雜質(zhì)如可溶性糖，因此上樣后先用水洗脫以除去極性較大的糖類物質(zhì)，而后按照實驗方法分別選用30%、50%、70%、90%的乙醇進行洗脫，測定結果見表3． 由表3 可知當洗脫劑質(zhì)量體積分數(shù)為30%時洗脫率最大，可收集到最多純液，故選用此質(zhì)量體積分數(shù)乙醇溶液作為洗脫劑．

表3 不同質(zhì)量體積分數(shù)乙醇對黃酮的洗脫效果Tab．3 The eluted effect on flavonoides of different concentration ethanol

2．2．4 黃酮純化溶液的收集 首先上樣使AB－8 樹脂對火棘果黃酮達到飽和吸附，而后用蒸餾水洗脫至無糖為止，接著用30%的乙醇進行洗脫，并按每管5 mL 收集洗脫液，以收集管數(shù)為橫坐標，洗脫液黃酮的吸光度為縱坐標繪制洗脫曲線，結果見圖3．由圖3 可以看出洗脫液共有一個洗脫峰，且6～16 管黃酮含量達到最高值，因此重復上樣，重復收集6～16 管，以制備純化黃酮．

圖3 AB－8 型大孔樹柱層析結果Fig．3 The column chromatography map of AB－8 type resin

2．3 火棘果黃酮提取液及純化后的抗氧化研究

2．3．1 對DPPH 自由基清除率的測定 分別測定收集制備的C3 火棘果黃酮與其他6 種未純化的火棘果黃酮對DPPH 自由基的清除作用，結果見表4．

半數(shù)清除質(zhì)量體積分數(shù)(IC50)被普遍采用作為評價抗氧化劑清除自由基能力強弱的指標．半數(shù)清除質(zhì)量體積分數(shù)即體系平衡后，自由基被半數(shù)消除時所需要加入抗氧化劑的質(zhì)量體積分數(shù)． 從表4 的IC50值可以看出，火棘果黃酮對DPPH 自由基具有很強的清除能力，尤其是C1、C4、C5、C6 顯著高于C2、C3 和純化后的C3，由此可見成熟度對火棘果黃酮抗氧化作用影響很大;此外純化后的火棘果黃酮對DPPH 自由基的清除能力強于未純化的，這可能是由于純化降低了火棘果黃酮中雜質(zhì)的干擾．

表4 火棘果黃酮及純化后火棘果黃酮對DPPH 自由基清除作用Tab．4 The inhibition effect on DPPH of flavonoide of Pyracantha fortuneana fruit and the purified

2．3．2 對超氧自由基清除率的測定 利用鄰苯三酚自氧化體系，研究收集制備的C3 火棘果黃酮與其他6 種未純化的火棘果黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用，結果見表5．

表5 火棘果黃酮及純化后黃酮對超氧自由基清除作用Tab．5 The inhibition effect on ultra oxygen free radical of flavonoide from Pyracantha fortuneana fruit and the purified

超氧自由基是機體代謝過程中產(chǎn)生的，在清除超氧自由基實驗中，火棘果黃酮表現(xiàn)出良好的清除能力，并且清除效果與黃酮質(zhì)量體積分數(shù)具有良好的量效關系．從表5 的IC50值可看出，實驗的6 個產(chǎn)地的火棘果黃酮對超氧自由基的抗氧化能力相差不大，同時純化后的火棘果黃酮對超氧自由基的清除能力與純化前的效果相當．

3 結論

通過以上試驗可以得出，成熟度較低的火棘果中黃酮的含量較高． 對3 種大孔樹脂的動態(tài)吸附和解吸效果進行了比較，得出AB－8 型大孔樹脂吸附率和解吸率都高一些，選擇性好，適于火棘果黃酮的分離純化．

在DPPH 體系和鄰苯三酚自氧化體系中，火棘果黃酮對DPPH 自由基和超氧自由基有顯著的清除效果，且隨著黃酮質(zhì)量體積分數(shù)升高，清除率也隨之升高．經(jīng)純化后的火棘果黃酮較純化前的火棘果黃酮抗氧化性有所增強．但是不同產(chǎn)地的火棘果黃酮對兩種自由基的清除能力不同，尤其是對DPPH 自由基的清除能力差異較大，這可能與其中所含的黃酮種類有關，此部分內(nèi)容有待于進一步深入研究．

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