張麗英,朱 萍,郭 相,何 容,張微思
(中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所,云南昆明650223)
竹葉菜,又名高大鹿藥、長柱鹿藥草(Smilacina atropurpurea),為百合科(Liliaceae)鹿藥屬一種具根狀莖的多年生草本植物。竹葉菜高30~60 cm;根狀莖橫走,粗1.0~1.5 cm,莖橫折狀,上部或中部以上被粗短毛[1]。葉似竹葉,所以稱竹葉菜。
竹葉菜主產(chǎn)于四川東南部及云南西北部海拔2 100~4 000 m的高海拔地區(qū)。土壤為森林棕壤,酸性,pH 值 4.5 ~7.2[2]。在秋末果實成熟以后地上部分枯死,地下的根狀莖處于休眠狀態(tài),在根狀莖上形成1~3個休眠芽。來年春夏之交(5月中旬~6月下旬),當(dāng)氣溫回升以后,地下的休眠芽開始萌動,休眠芽萌發(fā)后形成的幼芽采集后捆成把即在市場上銷售。竹葉菜營養(yǎng)豐富,是理想的減肥保健食品[3-4],其藥用價值也很高,全草供藥用,性寒,具清熱解毒,利尿消腫,潤肺等功效。竹葉菜作為一種野生蔬菜,在產(chǎn)區(qū)得到了當(dāng)?shù)赝林用窈统鞘芯用竦南矏?,但其繁殖系?shù)低、生長慢、目前難以人工栽培,使其進一步的開發(fā)利用受到限制。
組織培養(yǎng)可以在短時間內(nèi)通過少量的植株得到大量的可繁殖幼苗,很好的解決了資源有限、繁殖系數(shù)低、生長慢等問題,是竹葉菜資源可持續(xù)性利用的最好方法。本研究以帶地下根狀莖的芽做外植體,探索了竹葉菜的組織培養(yǎng)技術(shù),建立其組培快繁體系,為今后進行竹葉菜規(guī)?;卦耘嗪蜕a(chǎn)提供種苗及技術(shù)貯備,為竹葉菜資源的可持續(xù)開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。
滇西高山竹葉菜(Smilacina atropurpurea),采自云南迪慶。見圖1、2。
圖1 竹葉菜
圖2 竹葉菜地下根狀莖
1.2.1 培養(yǎng)基的配制
以MS為基本培養(yǎng)基,pH 值5.8~6.0,常規(guī)法配制。
1.2.2 外植體的消毒
取休眠地下莖上生長的頂芽為初始外植體,見圖1、圖2。用洗衣粉溶液洗去泥沙,然后加蓋紗布在自來水下小水沖洗1 h左右。移到超凈工作臺上,用75%酒精表面滅菌1 min,0.2%升汞浸泡16~18 min,無菌水沖洗7~10次。
1.2.3 芽外植體的誘導(dǎo)培養(yǎng)
切下頂芽(適當(dāng)帶一小塊地下根狀莖,以保證芽能成活),接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,在溫度20~24℃,光照時間13 h/d,相對濕度75% ~85%,光照強度2 000~4 000 lx的環(huán)境中進行培養(yǎng)。
1.2.4 誘導(dǎo)芽的繼代培養(yǎng)
將叢生芽和新梢切下來,轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上進行繼代增殖培養(yǎng)。
1.2.5 幼苗的生根
外植體在增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)8~9周后,幼芽成為多分枝的叢生苗,取新梢接種到生根培養(yǎng)基上。
1.2.6 煉苗
先將移栽好的竹葉菜置于培養(yǎng)室中,待有一定適應(yīng)能力后再完全移至室外,適應(yīng)后即可移栽至田間進行栽培。
將頂芽接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基,在前述培養(yǎng)條件下培養(yǎng),芽的生長情況見圖4和表1。
表1 芽外植體在不同培養(yǎng)基上的生長情況
從表1可以看出,適合竹葉菜芽外殖體誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基是 D5(MS+6-BA 1.5+NAA 0.05+0.6%瓊脂+3%蔗糖)。在D5中,外植體的出芽速度快,有1~2個叢生芽,芽生長健壯(見圖3)。
將D1和D4,D5相比,可以看出在竹葉菜芽誘導(dǎo)過程中6-BA配合NAA使用的效果比單獨使用6-BA的效果要好,并且6-BA/NAA的比值對芽的誘導(dǎo)有重要影響。如D2中6-BA/NAA的比值為5,D2出芽速度稍慢,叢生芽少;D4中6-BA/NAA的比值為7.5,芽多但出芽速度慢,而且出現(xiàn)基部膨大,有形成愈傷組織的傾向(見圖4);D5中6-BA/NAA的比值為30,出芽速度快,芽生長健壯,叢生芽多。說明6-BA/NAA的比值為30時較適合竹葉菜芽的誘導(dǎo)。李合生等[8-9]指出,當(dāng)分裂素/生長素比值高時,有利于誘導(dǎo)芽的分化,抑制衰老,但比值過高或過低都有礙外植體的生長誘導(dǎo),無法達(dá)到最適宜的程度。由于時間有限,實驗未能繼續(xù)嘗試6-BA/NAA的比值高于30的激素配比。
D3中加了GA(赤霉素),芽生長不夠健壯,說明在竹葉菜芽誘導(dǎo)培養(yǎng)不宜添加GA。
圖3 萌動的小芽
圖4 芽基部膨大
將誘導(dǎo)產(chǎn)生的小芽接入繼代培養(yǎng)基,在前述培養(yǎng)條件下培養(yǎng),促進芽的進一步分化(見圖5)。
圖5 在三種培養(yǎng)基中的繼代情況
從表2可以看出,最適合竹葉菜芽繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基是 D2(MS+6 - BA 1.2+NAA 0.05+0.6%瓊脂 +3%蔗糖)。在D2中,芽的增殖倍數(shù)較高(3.43倍),且出芽速度快,芽生長健壯;幼苗的葉泛綠,幼苗長勢好,生長快。D1為適合芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基,但在進行繼代培養(yǎng)時增殖倍數(shù)相對較低,幼苗生長較緩慢。
表2 芽在不同繼代培養(yǎng)基上的生長情況
D3出現(xiàn)失綠現(xiàn)象。這可能是6-BA過高的緣故。有研究報道[10],過高的細(xì)胞分裂素6-BA會影響小苗的生長,所以在組織培養(yǎng)時要適當(dāng)降低激素的濃度。D3中6-BA為1.5 mg/L,出現(xiàn)失綠;但D1中所加的6-BA也為1.5 mg/L,葉片卻泛綠。這可能是GA增強了6-BA在D3中的實際效果。GA對生長素和細(xì)胞分裂素的活性有增效作用[8,9]。由實驗可知6-BA濃度為1.2 mg/L~1.5 mg/L時可以保持竹葉菜組培幼苗葉片泛綠。
D3中還出現(xiàn)少量玻璃化現(xiàn)象。引起玻璃苗的可能原因主要集中在培養(yǎng)基水勢、激素種類和濃度、離子水平、溫度、光照等方面[11-14]。許多學(xué)者的研究報告指出,外源激素進入外植體,可能導(dǎo)致其激素含量過高,從而改變外植體內(nèi)的激素平衡狀況。生長素供應(yīng)過量也會誘導(dǎo)玻璃化[11-15]。本實驗中,D3較D1只多加了GA(赤霉素),結(jié)果D3中出現(xiàn)了明顯的玻璃化,而D1中卻沒有。這可能是GA(赤霉素)與6-BA,NAA共同作用,增強了6-BA和NAA的效果,導(dǎo)致生長素供應(yīng)過量。因為目前沒有任何報道說GA(赤霉素)會引起玻璃化。
將繼代培養(yǎng)產(chǎn)生的,長勢較一致的幼苗接入生根培養(yǎng)基,在前述培養(yǎng)條件下培養(yǎng),誘導(dǎo)幼苗生根。
表3 幼苗在不同培養(yǎng)基上的生根情況
從表3還可以看出,NAA與IAA(主要促進細(xì)胞伸長,一般不促分裂)配合,比NAA與6-BA配合,以及NAA與IAA和6-BA同時配合,其生根效果要好(見圖6)。適合竹葉菜無菌體小苗生根的培養(yǎng)基是 D3(MS+IAA 1.5+NAA 0.2+0.6%瓊脂 +3%蔗糖)。在D3中,幼苗易生根,根粗且長,且生長速度快(見圖7)。李合生等指出NAA可以促進細(xì)胞伸長和細(xì)胞分裂,有促進生根的作用[8,9]。NAA可配合6-BA使用,當(dāng)6-BA/NAA比值低時,有利于根的分化。
圖6 小苗在生根培養(yǎng)基中的生長情況
圖7 小苗在D3培養(yǎng)基中的生根情況
在以竹葉菜的頂芽為外植體的組織培養(yǎng)過程中,適合竹葉菜芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基是:MS+6-BA 1.5+NAA 0.05+0.6%瓊脂+3%蔗糖;繼代培養(yǎng)基是:MS+6 -BA 1.2+NAA 0.05+0.6% 瓊脂 +3%蔗糖;生根培養(yǎng)基是:MS+IAA 1.5+NAA 0.2+0.6%瓊脂+3%蔗糖。
繁殖中間體的誘導(dǎo)一般可通過三條途徑:器官發(fā)生途徑、愈傷組織誘導(dǎo)及分化再生途徑、胚狀體發(fā)生途徑[16-18]。考慮到竹葉菜葉的角質(zhì)層較厚,葉較硬,不適合用于誘導(dǎo)愈傷組織,而且產(chǎn)生愈傷組織的周期較長,愈傷組織誘導(dǎo)及分化再生過程中易發(fā)生變異,近年來人們對由愈傷組織分化出苗會帶來變異的擔(dān)心在不斷增加。所以本試驗選用帶地下根狀莖的芽作為外植體進行組織培養(yǎng),通過以芽生芽,形成叢生芽,從而建立繁殖中間體。一般來說,只要培養(yǎng)基適合,用腋芽或頂芽作外殖體比較容易成功[16,19]。
在外植體培養(yǎng)過程中污染較為嚴(yán)重,污染率達(dá)30% ~40%。分析其原因,可能是:竹葉菜的植株較大,地下莖上覆土較多且長有大量的須根,將須根除去才好徹底清洗和消毒。但這會使外植體上留下切口,細(xì)菌從切口侵入,造成污染;其外植體較大,在滅菌過程中易出現(xiàn)滅菌不徹底;外植體在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)很多的內(nèi)生細(xì)菌,使得滅菌更加困難。如果要得到很好的組織培養(yǎng)效果,就需要在外植體取材方面進行著手,盡量獲得比較細(xì)嫩且健壯的外植體;在清洗時要盡量先清洗干凈再除須根;提高升汞濃度,延長升汞處理時間,盡可能徹底地滅菌(經(jīng)過不斷摸索,發(fā)現(xiàn)用0.2%升汞浸泡16~18min的滅菌效果是最好的);接種時每瓶所接芽數(shù)不宜多,最好不超過3個,通過降低污染概率來降低污染率;發(fā)現(xiàn)瓶內(nèi)有內(nèi)生菌時,對尚未被污染的外植體要及時地轉(zhuǎn)接;還要求操作人員操作正確、熟練,避免操作過程中造成污染。
竹葉菜的芽具有較強的休眠性,在實驗過程中曾試圖用GA(赤霉素)打破芽的休眠。但從實驗結(jié)果來看,在竹葉菜組織培養(yǎng)過程中,不宜在培養(yǎng)基中添加GA(赤霉素),添加雖然可以在一定程度上提高出芽率和出芽速度,但會使芽生長不夠健壯,幼苗出現(xiàn)失綠和玻璃化現(xiàn)象。
經(jīng)過幾次繼代培養(yǎng)后,幼芽成為多分枝的叢生苗,再繼代分化時分化速度和分化率都降低,增殖的速度減慢。這時應(yīng)及時繼代,以免組織老化[19]。同時將可以生根的幼苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基。
煉苗時,要注意仔細(xì)洗去附著在幼苗根部上的培養(yǎng)基,將生根幼苗移植在采自竹葉菜生境地的土壤上,剛開始的時候周圍溫度與培養(yǎng)時溫度的差值不能超過5℃。逐步降低周圍的溫度,直到移栽幼苗適應(yīng)室溫。管理過程中每隔兩天要澆一次水,但每次澆水不能多,以免爛根。這是移栽成活的關(guān)鍵。通過試驗和觀察、統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)在組培過程中竹葉菜的生長周期長、生長比較緩慢;喜愛低溫、高濕度、短光照的生長環(huán)境。
致謝:云南大學(xué)李宗菊老師和云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院嚴(yán)家云老師對本實驗給予了大力支持和幫助,在此表示感謝。
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