薄荷不同溶劑提取物抗氧化活性的研究

陳智坤，梁呈元，李維林，任冰如，馬 麗

(江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所，江蘇南京210014)

薄荷(Mentha canadensisL.)為唇形科薄荷屬植物，主要分布在中國(guó)、日本、韓國(guó)、俄羅斯及北美等地區(qū)［1］，作為重要的藥食兩用植物，其被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品、香料、煙草等工業(yè)。我國(guó)約有兩千年的薄荷藥食歷史，具有散風(fēng)熱清頭目、利咽喉、透疹、解郁等功效，主治風(fēng)熱表證，頭痛目赤，咽喉腫痛，麻疹不透，隱疹瘙癢，肝郁脅痛［2］。研究表明薄荷屬植物主要含有揮發(fā)油、黃酮、多酚、萜類、氨基酸等成分，具有抗氧化、抗菌、抗癌、抗糖尿病等作用［3］?，F(xiàn)代研究表明，抗氧化劑具有延緩人體衰老，降低多種疾病產(chǎn)生，增強(qiáng)人體免疫能力等多種功能。因此，研究開(kāi)發(fā)廣譜、高效、安全的天然抗氧化劑已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一［4-7］。目前，薄荷屬植物抗氧化活性研究已有相關(guān)報(bào)道，研究結(jié)果顯示該屬植物表現(xiàn)出良好的抗氧化能力［8-11］。本文采用 DPPH、ABTS、FRAP三種模型對(duì)薄荷的水、甲醇、70%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯五種提取物進(jìn)行抗氧化體外活性研究，并測(cè)定其總酚和總黃酮含量，進(jìn)行相關(guān)性分析，為進(jìn)一步研究薄荷的抗氧活性及資源開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薄荷 采自南京中山植物園薄荷資源苗圃，經(jīng)梁呈元研究員鑒定為薄荷(M.canadensisL.)，在恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)105℃殺青15min，60℃干燥3h，粉碎過(guò)60目篩備用;DPPH、ABTS Sigma公司;FRAP試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所;沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;蘆丁對(duì)照品 中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):100080-200306;其他試劑均為分析純。

Infinite M200型酶標(biāo)儀 TECAN公司;R-Ⅱ型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 BUCHI公司;EL204型電子天平Mettler Toledo公司;KQ-300DE型超聲儀 昆山超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取方法 薄荷干藥材25g，料液比1∶20，超聲功率100W，50℃、30min下分別用水、甲醇、70%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯超聲提取兩次，趁熱抽濾并濃縮得到黑色浸膏，置60℃恒溫烘箱干燥24h至重量不發(fā)生改變，得到黑色固體質(zhì)量分別為4.2、3.8、3.4、0.7、0.8g。

1.2.2 抗氧化活性的測(cè)定

1.2.2.1 清除DPPH自由基實(shí)驗(yàn) 取不同提取物，DMSO溶解，配制成10mg/L母液。DPPH用無(wú)水乙醇配制成0.16mmol/L，置于棕色瓶中備用。在96孔板中，每孔分別入20μL不同濃度的樣品溶液，80μL超純水和 100μL的 0.16mmol/L DPPH，反應(yīng)體系200μL。加樣后室溫避光振蕩15min，將96孔板放入酶標(biāo)儀中在517nm波長(zhǎng)處檢測(cè)樣品的吸光度(Ai);取20mL DMSO代替樣品溶液測(cè)得空白吸光度(A0);以100μL無(wú)水乙醇代替DPPH溶液測(cè)得樣品本底吸光度(Aj);每個(gè)濃度做4個(gè)平行，取其平均值。以VC做陽(yáng)性對(duì)照，按式(1)計(jì)算清除率，并計(jì)算出EC50值［12］。

1.2.2.2 清除ABTS自由基實(shí)驗(yàn) ABTS混合液的制備:將7mmol/L ABTS水溶液與2.45mmol/L過(guò)硫酸鉀水溶液(終濃度)混合，將混合液在室溫避光條件下放置12～16h，形成ABTS儲(chǔ)備液。將此工作液與乙醇按照約1∶20(v/v)的比例混合在734nm下調(diào)吸光度為0.700±0.02即得，于30℃下預(yù)熱備用。在96孔板中，每孔分別入10μL不同濃度的樣品溶液，190μL ABTS 混合液，反應(yīng)體系200μL。反應(yīng)10s，靜置10min，將96孔板放入酶標(biāo)儀中在734nm波長(zhǎng)處檢測(cè)樣品的吸光度(Ai);取10μL DMSO代替樣品溶液測(cè)得空白吸光度(A0);以190μL無(wú)水乙醇代替ABTS混合液測(cè)得樣品本底吸光度(Aj);每個(gè)濃度做4個(gè)平行，取其平均值。以VC做陽(yáng)性對(duì)照，按式(1)計(jì)算清除率，并計(jì)算出 EC50值［13］。

1.2.2.3 FRAP法抗氧化實(shí)驗(yàn) 按說(shuō)明書(shū)，稱取27.8mg FeSO4·7H2O，用去離子水溶解、定容至1mL，即濃度為100mmol/L。取適量 FeSO4溶液稀釋至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mmol/L。在 96 孔板中，每孔分別入180μL現(xiàn)配的FRAP工作液，加入5μL去離子水做空白對(duì)照，5μL各種濃度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，反應(yīng)體系為 185μL，在 37℃下反應(yīng) 3～5min，在593nm下測(cè)定吸光度，每個(gè)檢測(cè)做4個(gè)重復(fù)，取其平均值，以Trolox為陽(yáng)性對(duì)照。最后根據(jù)FRAP標(biāo)準(zhǔn)曲線求得各樣品的抗氧化能力。

1.2.3 含量測(cè)定

1.2.3.1 總黃酮含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取120℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20mg，置于100mL容量瓶中，用60%乙醇溶解并定容得到濃度為0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確移取 0、10、20、30、40、50、60μL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于96孔平板中，每孔先分別用60%乙醇補(bǔ)齊至104μL，再依次加入8μL 5%NaNO2溶液，搖勻，靜置6min;加入8μL 10%Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6min;再加入80μL的1mol/L NaOH溶液，搖勻，靜置15min;將96孔平板放入酶標(biāo)儀中在510nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值，每個(gè)檢測(cè)做4個(gè)重復(fù)，取其平均值。最后根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線求得各樣品的總黃酮含量。

1.2.3.2 總酚含量的測(cè)定 精密稱取15mg沒(méi)食子酸置于10mL容量瓶中，用蒸餾水溶解后定容至刻度，搖勻，配制成1.5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，轉(zhuǎn)移至棕色瓶中以備用;配制100mg/mL Na2CO3溶液。在96孔板中依次加入沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0、1、2、4、6、8μL，用蒸餾水將每個(gè)加樣孔補(bǔ)至50μL，然后分別加入50μL Folin-Ciocalteu試劑，振蕩3min后加入50μL 100mg/mL Na2CO3溶液充分混勻，在室溫下放置5h后，將96孔板放入酶標(biāo)儀中在760nm波長(zhǎng)處測(cè)定各樣品的吸光值，每個(gè)檢測(cè)做4個(gè)重復(fù)，取其平均值。最后根據(jù)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線求得各樣品的總酚含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA法)和雙變量相關(guān)性分析，同時(shí)進(jìn)行LSD兩兩比較，以p＜0.05為差異顯著，所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉ±s)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)DPPH自由基的清除作用

由圖1和表1可見(jiàn)，薄荷五種不同提取物均對(duì)DPPH自由基表現(xiàn)良好的清除能力，在0.3125～5mg/mL范圍內(nèi)，抗氧化活性隨濃度升高而升高，在水提物濃度為5mg/mL時(shí)抑制率達(dá)到最大為88.68%，DPPH自由基清除能力大小順序?yàn)?水＞正丁醇＞乙酸乙酯＞甲醇＞70%乙醇。

圖1 薄荷不同提取物對(duì)DPPH自由基清除率(%)Fig.1 Percentage of free radical scavenging activity of different extracts from Mentha canadensis L.by DPPH radicals in vitro assay

2.2 對(duì)ABTS自由基的清除作用

由圖2、表2可見(jiàn)，薄荷五種不同提取部位對(duì)ABTS自由基均具有一定的清除能力，但相對(duì)清除DPPH自由基能力較弱，且清除率隨濃度的升高和升高，其中甲醇在10mg/m L時(shí)對(duì)ABTS自由基清除率達(dá)到95.44%，提取物對(duì)ABTS自由基的清除順序?yàn)?甲醇＞水＞乙酸乙酯＞正丁醇＞70%乙醇。

表1 薄荷不同提取物對(duì)DPPH自由基清除的EC50值(p＜0.05)Table 1 The EC50 of different extracts from Mentha canadensis L.by DPPH radicals in vitro assay(p＜0.05)

表2 薄荷不同提取物對(duì)ABTS自由基的清除的EC50值(p＜0.05)Table 2 The EC50 of different extracts from Mentha canadensis L.by DPPH radicals in vitro assay(p＜0.05)

表3 薄荷不同提取部位FARP值(p＜0.01)Table 3 The FARP value of different extracts from Mentha canadensis L.by FARP in vitro assay(p＜0.01)

表4 薄荷不同提取物中多酚含量(p＜0.05)Table 4 Total phenolic content in different extracts from Mentha canadensis L.(p＜0.05)

表5 薄荷不同提取部位中總黃酮含量(p＜0.01)Table 5 Total flavonoids content in different extracts from Mentha canadensis L.(p＜0.01)

圖2 薄荷不同提取物對(duì)ABTS自由基清除率Fig.2 Percentage of free radical scavenging activity of different extracts from Mentha canadensis L.by ABTS radicals in vitro assay

2.3 FRAP法測(cè)定抗氧化能力

樣品的抗氧化活性由FARP標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=0.0286X+0.0686(R2=0.9907)換算得來(lái)，各提取部位的抗氧化活性如表3所示。

由表3可見(jiàn)，通過(guò)FARP法測(cè)定薄荷五種不同提取部位總抗氧化能力順序?yàn)?乙酸乙酯＞正丁醇＞水＞甲醇＞70%乙醇。

2.4 總酚的含量測(cè)定

樣品中的多酚含量由沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=46.9X-0.0283(R2=0.9922)換算得來(lái)，各提取部位的多酚含量如表4所示。

由表4可見(jiàn)，五種提取方法中，總酚含量順序?yàn)?，水＞乙酸乙酯＞正丁醇＞甲醇?0%乙醇，其中水提取物中多酚含量最高，這與大多數(shù)多酚屬大極性化合物，易溶于大極性溶劑有關(guān)。

2.5 總黃酮的含量測(cè)定

樣品中的總黃酮含量由沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=5.834X+0.0416(R2=0.9992)換算得來(lái)，各提取部位的總黃酮含量如表5所示。

由表5可見(jiàn)，甲醇提取物中黃酮類化合物含量最高，乙酸乙酯提取物中黃酮含量較多，水提取物中黃酮含量較少，這與薄荷中可能含有中等極性黃酮類成分較多有關(guān)。

2.6 抗氧化活性間相關(guān)性分析

在數(shù)據(jù)處理時(shí)，因在一定范圍內(nèi)，EC50越小代表抗氧化能力越強(qiáng)，因此對(duì)于計(jì)算有關(guān)EC50相關(guān)性存在負(fù)號(hào)(-)現(xiàn)象，應(yīng)作正相關(guān)處理。由表6可見(jiàn)薄荷提取物對(duì)DPPH、ABTS、FRAP抗氧化活性基本一致，但略有差別，這可能與各抗氧化模型作用機(jī)理不同有關(guān)。

表6 薄荷抗氧化活性間相關(guān)系數(shù)(r)Table 6 Correlation coefficient(r)of treemodels of antioxidant activity

2.7 多酚、黃酮含量與抗氧化活性相關(guān)性分析

現(xiàn)代研究表明抗氧化活性與植物體中多酚和黃酮含量有密切的關(guān)系［14］，因此對(duì)不同提取部位的多酚和黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行相關(guān)性分析，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析尋找薄荷產(chǎn)生抗氧化活性的主要原因。

由表7可見(jiàn)，薄荷各提取物對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基、FARP的抗氧化活性與多酚含量均顯示出極顯著正相關(guān)性，即在一定范圍內(nèi)多酚含量越高，對(duì)三種抗氧化模型的活性越強(qiáng);而提取物對(duì)DPPH和ABTS的抗氧化活性與黃酮含量顯示相關(guān)性不高，F(xiàn)ARP的抗氧化活性與黃酮含量則顯示顯著正相關(guān)。

表7 薄荷抗氧化活性與其多酚、總黃酮含量的相關(guān)系數(shù)(r)Table 7 The relationship between the antioxidant activity and the content of total phenolics and total flavonoids

3 結(jié)論

薄荷表現(xiàn)出對(duì) DPPH自由基、ABTS自由基、FRAP良好的抗氧化能力，且相關(guān)性基本一致，其活性部位主要集中在大極性化合物上。其中水和甲醇提取部位抗氧化能力相對(duì)較高，正丁醇和乙酸乙酯次之，70%乙醇相對(duì)較弱。經(jīng)抗氧化活性與多酚和黃酮含量相關(guān)性數(shù)據(jù)分析顯示，薄荷抗氧化活性與多酚含量有密切關(guān)系，與黃酮含量相關(guān)性較小，這一結(jié)果與 Tupe［9，15-18］等研究薄荷屬植物抗氧化結(jié)果基本一致。薄荷屬植物作為重要的芳香植物，目前，研究其揮發(fā)性成分相對(duì)較多，本實(shí)驗(yàn)對(duì)薄荷的非揮發(fā)性提取部位的抗氧化活性研究，將為進(jìn)一步研究其活性成分奠定基石，為尋找其抗氧化活性機(jī)理提供依據(jù)，為未來(lái)薄荷屬植物的資源開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

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