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    白花蛇舌草揮發(fā)油對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制作用

    2013-12-07 08:32:12王麗麗蔡巧燕詹友知陳達(dá)鑫
    福建中醫(yī)藥 2013年3期
    關(guān)鍵詞:白花蛇舌草揮發(fā)油

    王麗麗 ,林 婧 ,蔡巧燕 ,詹友知 ,陳達(dá)鑫 ,彭 軍

    (1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院,福建 福州350122;2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州350122)

    原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC,簡(jiǎn)稱肝癌)是最常見的原發(fā)性肝腫瘤,發(fā)病率居全球惡性腫瘤的第5位,病死率居第3位[1]。白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willd,HDW)的全草,其主要化學(xué)成分有熊果酸、免疫多糖、烏索酸、白花蛇舌草素等,具有增強(qiáng)免疫活性、抗氧化和抗腫瘤活性,現(xiàn)廣泛用于治療各種炎癥和腫瘤[2-6]。白花蛇舌草揮發(fā)油主要成分為十六酸,亞油酸,9-十八碳烯酸,龍腦,6,10,14-三甲基-2-十五烷酮,4-乙烯基-2-甲氧基苯酚等[7-8]。目前國(guó)內(nèi)外均未見其抗腫瘤活性的相關(guān)報(bào)道。本文對(duì)白花蛇舌草揮發(fā)油對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞活性進(jìn)行了研究,為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

    1 材 料

    1.1 材料與細(xì)胞株 白花蛇舌草購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂;肝癌HepG2細(xì)胞細(xì)胞株均購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。

    1.2 試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司;MTT購(gòu)自Sigma公司。

    1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(Heal Force),ELX800酶標(biāo)儀(BioTek),IX70熒光倒置相差顯微鏡(Olympus)。

    2 方 法

    2.1 白花蛇舌草揮發(fā)油的制備 取白花蛇舌草樣品200 g,粉碎成粗粉,過40目篩,稱量200 g,加入2 000 mL水,浸泡10 h,按《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版附錄揮發(fā)油測(cè)定法,回流提取6 h,采用乙醚做吸收溶劑,乙醚用量為5 mL,得揮發(fā)性成分乙醚提取液,加入無水硫酸鈉,得無水揮發(fā)油(0.09%),得到的油用DMSO超聲溶解,配置成200 mg/mL溶液,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞經(jīng)含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基(含 100 U/mL青霉素和 100 μg/mL鏈霉素)培養(yǎng),置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

    2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),HepG2以4×105個(gè)/mL接種于96孔板中,接種體積為 100 μL/孔,置 37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),至細(xì)胞貼壁,且覆蓋率達(dá)60%時(shí),分別加入62.5、125、250、500、1 000 μg/mL 的白花蛇舌草揮發(fā)油,24 h后吸取各孔溶液,每孔加入100 μL的0.5 mg/mL MTT 溶液,37℃培養(yǎng) 4 h。4 h后,小心吸去孔內(nèi)液體。往每孔內(nèi)加入100 μL DMSO,振蕩10 min后,在570 nm處測(cè)OD值。計(jì)算細(xì)胞活力,方程如下:

    細(xì)胞活力(%)=[實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值]×100%。

    2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 人肝癌細(xì)胞HepG2經(jīng)不同濃度的白花蛇舌草揮發(fā)油提取物干預(yù)24 h后,置于倒置顯微鏡下觀察,并拍照。

    2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel 2003和DPS v6.55軟件進(jìn)行分析處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示,組間比較采用單因素方差分析。

    3 結(jié) 果

    3.1 白花蛇舌草揮發(fā)油提取物對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響 白花蛇舌草揮發(fā)油提取物對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)存在明顯的抑制作用,并且隨濃度的加大而增大,與空白組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IC50值為 369.3 μg/mL,結(jié)果見圖 1。

    圖1 白花蛇舌草揮發(fā)油提取物對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響

    3.2 白花蛇舌草揮發(fā)油提取物對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響 在倒置顯微鏡下觀察可以看出:對(duì)照組的HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)良好,主要以近圓形和梭型2種形態(tài)存在,核仁清晰,胞質(zhì)均勻,細(xì)胞舒展拉伸。而隨著給藥劑量的增加,懸浮的死細(xì)胞數(shù)量增多,貼壁細(xì)胞數(shù)量則顯著下降,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,胞質(zhì)、核仁逐漸固縮,細(xì)胞體積變小,變圓,在顯微鏡下可看到胞內(nèi)空泡變多。結(jié)果表明:白花蛇舌草揮發(fā)油對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用且呈現(xiàn)顯著的劑量依賴性,見圖2。

    圖2 白花蛇舌草揮發(fā)油對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響(200×)

    4 討 論

    肝癌與胃癌、肺癌等其它實(shí)體瘤有明顯的不同,肝功能惡化和肝硬化的合并癥一直是肝癌患者的主要死因之一。因此,在肝癌的治療過程中,必須保護(hù)肝功能和機(jī)體的免疫機(jī)制[9],但是目前的抗腫瘤藥物的毒副作用大而且容易產(chǎn)生耐藥性,因而治療效果不理想。天然中藥具有療效廣泛,毒副作用相對(duì)較小,作用效果明顯等優(yōu)勢(shì)[10-12]。揮發(fā)油成分多是小分子物質(zhì),能被機(jī)體快速吸收,作用廣泛,且多具芳香開竅、引藥上行的功用,在心腦血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)、抗菌、抗炎、抗癌、抗病毒、促進(jìn)藥物吸收等多方面都具有功效。

    白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草的全草,具有增強(qiáng)免疫活性、抗氧化和抗腫瘤活性,現(xiàn)廣泛用于治療各種炎癥和腫瘤[13-14]。其揮發(fā)油主要成分為十六酸,亞油酸,9-十八碳烯酸,龍腦,6,10,14-三甲基-2-十五烷酮,4-乙烯基-2-甲氧基苯酚等。本研究采用白花蛇舌草的揮發(fā)油,探討其對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的影響。研究發(fā)現(xiàn),白花蛇舌草揮發(fā)油干預(yù)后,人肝癌HepG2細(xì)胞密度明顯減少,細(xì)胞變小,且對(duì)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活力也有顯著的抑制作用,并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性,表明白花蛇舌草揮發(fā)油對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞有明顯的抑制作用。

    [1]SIEGEL R,NAISHADHAM D,JEMAL A.Cancer statistics,2013[J].CA Cancer J Clin,2013,63(1):11-30.

    [2]葉榕,林久茂,魏麗慧,等.白花蛇舌草乙醇提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖及Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)通路表達(dá)的影響[J].海峽科學(xué),2012,6(8):100-102.

    [3]魏麗慧,林久茂,彭軍,等.白花蛇舌草乙醇提取物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29 Pim-1和Pim-2 mRNA表達(dá)的影響[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2011,6(4):284-287.

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