急進(jìn)高原后外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)相關(guān)易感基因表達(dá)與急性高原反應(yīng)分析

方盼盼，宮璀璀* ，倉寶成，李正民，李宗杰，李文莉，朱傳杰，王迎濤

(1.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院科研中心，河南鄭州450052;2.中國人民解放軍第153中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450042)

急性高原反應(yīng)(acute mountain sickness，AMS)是機(jī)體對(duì)高原環(huán)境的一種應(yīng)激性反應(yīng)，是機(jī)體的各種功能通過神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)在新的基礎(chǔ)上達(dá)到新的平衡過程中所呈現(xiàn)的臨床癥狀。急性高原反應(yīng)的癥狀包括頭痛、心慌、食欲減退、倦怠、惡心、手足麻木和抽搐等。AMS如早期被發(fā)現(xiàn)，癥狀是可以控制的，但若發(fā)現(xiàn)晚，病情則迅速加重，導(dǎo)致腦肺水腫甚至威脅到生命［1］。因此，對(duì)AMS進(jìn)行及時(shí)干預(yù)非常必要，目前對(duì)于AMS的預(yù)防尚無較理想的方法和檢測(cè)手段。本研究觀察受試者急進(jìn)海拔4 000 m高度48 h前后單個(gè)核細(xì)胞中低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducing factor 1，HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和 P38 MAPK 的變化及其與AMS的關(guān)系，為AMS的早期防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司);鼠抗人多克隆抗體和抗鼠二抗試劑盒(Santa Cruz公司);Trizol(Invitrogen公司);PCR試劑盒(Tiangen公司);VEGF、HIF-1α、P38 MAPK以及內(nèi)參引物(上海生工公司合成)。

1.2 研究對(duì)象

某部隊(duì)赴青海省玉樹抗震的官兵30人，其中男性23人，女性7人，年齡22～34歲，乘汽車急行軍于24 h內(nèi)到達(dá)海拔4 000 m高度，48 h抵達(dá)玉樹。出發(fā)前和到達(dá)玉樹48 h后分別采取外周血，以枸櫞酸鈉抗凝。

1.3 單個(gè)核細(xì)胞提取

用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，加入5倍體積單個(gè)核細(xì)胞懸液的預(yù)冷的PBS(每毫升PBS中加入磷酸酶抑制劑0.05 mL，以限制進(jìn)一步的蛋白質(zhì)修飾)洗滌2次，176×g離心9 min后棄去上清液，加入預(yù)冷的PBS將單個(gè)核細(xì)胞懸液的體積還原至1 mL，計(jì)數(shù)單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量。

1.4 cDNA合成

Trizol 試劑提取RNA，核酸定量?jī)x檢測(cè)RNA含量。cDNA的合成采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，內(nèi)參管:2μL內(nèi)參RNA(50 mg/L)、1μL隨機(jī)引物、4μL 5×緩沖液、1μL RNA 酶抑制劑、2μL 10 mmol/L單脫氧核苷酸混合物、1μL反轉(zhuǎn)錄酶、9μL雙蒸水;樣本管:10μL樣本 RNA、1μL隨機(jī)引物、4μL 5×緩沖液、1μL RNA酶抑制劑、2μL 10 mmol/L單脫氧核苷酸混合物、1μL反轉(zhuǎn)錄酶、1μL雙蒸水。反轉(zhuǎn)錄程序:25℃，5 min;42℃，60 min;70℃，5 min;4℃ 緩沖30 min。

1.5 RT-PCR

以cDNA作為模板，擴(kuò)增目的基因片段:建立25μL的反應(yīng)體系:2μL的 cDNA，12.5μL Master-Mix，上下游引物的應(yīng)用混合液1μL，9.5μL的ddH2O。設(shè)計(jì)引物:HIF-1α正義引物:5'-AATGA AGTGTACCCTAACTAGCCG-3'，反義引物:5'-GTTC ACAAATCAGCACCAAGC-3';P38正義引物:5'-GTG TCTGTCTTTGTGGGAGGGTA-3'，反義引物:5'-TGGG ATGTTGTCAAGTCTACGC-3';β-actin正義引物:5'-G AGCTACGAGCTGCCTGACG-3'，反義引物:5'-CCTA GAAGCATTTGCGGTGG-3'。反應(yīng)條件:95℃(預(yù)處理)，5 min;95 ℃(變性)，50 s;55 ℃(退火)，50 s;72℃(延伸)，50 s;35個(gè)循環(huán)，72℃，5 min;4℃緩沖60 min。以目的基因/β-actin吸光度比值的均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示結(jié)果。

1.6 Western blot方法

應(yīng)用Trizol提取蛋白質(zhì)，以布拉德福德法測(cè)定并調(diào)節(jié)各組總蛋白濃度。制備SDS-PAGE凝膠，電泳條件120 V、2.5 h。應(yīng)用電轉(zhuǎn)儀4℃下轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NCM)上，轉(zhuǎn)膜條件58 V、4 h，將NCM與1∶1 000稀釋 的各種一抗室溫下反應(yīng)2 h，再與1∶200稀釋的二抗(鼠 IgG-HRP)室溫下反應(yīng)1 h。加入DAB底物溶液，顯色20～30 min，同時(shí)進(jìn)行 β-actin的內(nèi)參照，陽性條帶呈現(xiàn)棕色后用水終止反應(yīng)，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)(ALPHA.HP)進(jìn)行掃描。以目的蛋白/β-actin吸光度比值的均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示結(jié)果。

1.7 AMS診斷

根據(jù)GB1098291《急性高原反應(yīng)的診斷和處理原則》對(duì)進(jìn)入玉樹高原的官兵進(jìn)行體檢，確診是否發(fā)生急性高原反應(yīng)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，采用正態(tài)性檢驗(yàn)之后進(jìn)行兩配對(duì)樣本的t檢驗(yàn)及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 急進(jìn)海拔4 000 m高度后AMS的發(fā)生率

30名官兵中，有18人發(fā)生急性高原反應(yīng)，發(fā)生率為60.0%。其中輕度反應(yīng)者10例，占55.6%;中度反應(yīng)者5例，占27.8%;重度反應(yīng)者3例，占16.7%。

2.2 急進(jìn)海拔4 000 m高度后單個(gè)核細(xì)胞中HIF-1α和P38 MAPK mRNA表達(dá)水平

單個(gè)核細(xì)胞中HIF-1αmRNA和P38 MAPK mRNA進(jìn)入高原前(圖1A)和高原后(圖1B)表達(dá)水平符合正態(tài)檢驗(yàn)，進(jìn)入高原后兩者mRNA分別是1.38±0.31和0.85±0.21顯著高于進(jìn)入高原前的0.46±0.16和0.64±0.11(p＜0.001)。

2.3 急進(jìn)海拔4 000 m高度后單個(gè)核細(xì)胞中HIF-1α、VEGF蛋白質(zhì)的表達(dá)水平

單個(gè)核細(xì)胞中HIF-1α和VEGF(圖2)蛋白進(jìn)入高原前后表達(dá)水平符合正態(tài)性，進(jìn)入高原后兩者的蛋白表達(dá)分別是0.99±0.12和0.765±0.11均顯著高于進(jìn)入高原前的0.84±0.13和0.65±0.10(p＜0.001)。

2.4 急進(jìn)海拔4 000 m高度后單個(gè)核細(xì)胞中HIF-1α和VEGF蛋白質(zhì)表達(dá)水平相關(guān)性分析

由平原進(jìn)入高原后HIF-1α和VEGF蛋白質(zhì)的表達(dá)上調(diào)，兩者呈正相關(guān)(p＜0.001)。

2.5 HIF-1α、VEGF和P38 MAPK與AMS相關(guān)性分析

HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)與AMS發(fā)病程度之間呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.875和0.675(p＜0.001);P38 MAPK mRNA表達(dá)與AMS發(fā)病程度無相關(guān)性。

3 討論

AMS治療和預(yù)防的關(guān)鍵是早期診斷，確診的時(shí)間越早，治療的成功率就越高［1］。在低氧或無氧狀態(tài)下，HIF-1不發(fā)生羥基化，對(duì)缺血或缺氧應(yīng)激基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄［2］。應(yīng)用過氧化氫和活性氧(reactive oxygen species，ROS)可誘導(dǎo)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)中HIF-1α mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平增加，HIF-1αmRNA的表達(dá)峰值出現(xiàn)在2 h，而蛋白質(zhì)表達(dá)峰值出現(xiàn)在4 h，二者之間存在表達(dá)時(shí)間點(diǎn)的差異［3］。本研究結(jié)果顯示，在到達(dá)海拔4 400 m高度48 h后，雖然 HIF-1α mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量均有顯著性的增加，但二者之間不存在相關(guān)性。HIF-1α蛋白質(zhì)表達(dá)水平與AMS之間存在顯著正相關(guān)，HIF-1αmRNA與 AMS之間無相關(guān)性，是否與表達(dá)時(shí)間點(diǎn)的不同有關(guān)，有待進(jìn)一步探討。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和P38 MAPK在低氧狀況下的組織或細(xì)胞中表達(dá)大量增加，低氧是刺激血管重塑、改變細(xì)胞通透性、血管再生的最重要因素［4－5］。低氧誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡可通過 NF-κB和 P38 MAPK轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子通路介導(dǎo)［6］。用 CoCl2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)生低氧應(yīng)激損傷中，ROS和P38 MAPK磷酸化明顯增加［7］。

HIF-1被認(rèn)為是上調(diào)VEGF的主要調(diào)節(jié)因子［8－10］。在 HIF 的介導(dǎo)下，VEGF mRNA 轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定性增加，且VEGF受體表達(dá)上調(diào)，VEGF的生物學(xué)效應(yīng)增強(qiáng)［11］。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF的表達(dá)與 P38 MAPK有直接關(guān)系。在低氧誘導(dǎo)培養(yǎng)的人內(nèi)皮細(xì)胞中，VEGF的分泌量明顯增加，應(yīng)用P38 MAPK的阻斷劑可以阻斷VEGF的生成［12］。本研究結(jié)果提示VEGF表達(dá)水平的增加可能與HIF-1α的調(diào)控有關(guān)。但是否也存在P38 MAPK的調(diào)控作用，或者同時(shí)存在HIF-1α和P38 MAPK的共同調(diào)控作用而導(dǎo)致VEGF蛋白質(zhì)的表達(dá)水平增加還有待進(jìn)一步的探討。

結(jié)論，急進(jìn)高原后HIF-1α、P38 MAPK和VEGF均表達(dá)上調(diào)，HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)水平與AMS發(fā)病呈顯著正相關(guān)，其中VEGF表達(dá)水平的增加可能與HIF-1α或與P38 MAPK的調(diào)控作用有關(guān)。

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