曲古抑菌素A對缺糖/缺氧損傷PC12細胞的保護作用

越茂松，黃 瓊，王進京，季秋虹，季煜華，3

(1.暨南大學 生命科學技術(shù)學院 組織移植與免疫研究中心廣州 510632，2.南通大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南通 226001，3.暨南大學功能蛋白質(zhì)研究廣東普通高校重點實驗室廣州 510632)

缺血性腦卒中是世界范圍內(nèi)導致成年死亡和殘疾的重要原因，但目前除了溶栓治療外還缺乏其他理想的治療藥物和手段［1］。乙?；且环N重要的表觀遺傳調(diào)控機制，組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(Histone acetyltransferases，HATs)和組蛋白去乙?；?Histone deacetylases，HDACs)維持和調(diào)節(jié)著機體中蛋白質(zhì)乙?；降膭討B(tài)平衡［2］。近年來，一系列的報道證實了卒中以及多種神經(jīng)退行性疾病(HD，

Alzheimer等)都伴隨著HATs蛋白量/活性的下降和HDACs活性的相對增加，而通過組蛋白去乙?；敢种苿?Histone deacetylase inhibtor，HDACis)抑制HDACs的活性，增加乙?；娇山档蜕窠?jīng)元損傷的程度并促進其功能的恢復［3－5］。曲古抑菌素A(TSA)是一種泛去乙酰化酶抑制劑，通過改變?nèi)旧|(zhì)折疊構(gòu)象調(diào)節(jié)基因表達和改變蛋白質(zhì)乙?；秸{(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能。［4，6］本研究擬檢測 TSA對 PC12細胞OGD損傷模型的作用并探討可能的機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 PC12，ATCC;TSA，碧云天生物技術(shù)研究所;DMEM無糖培養(yǎng)基，美國Sigma公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和馬血清，美國Gibco公司;MTT，美國 Sigma公司;DCFH-DA，碧云天生物技術(shù)研究所;超凈工作臺(水平流型)，中國ESCO公司;CO2細胞培養(yǎng)箱(2300型)，美國公司Sheldon公司;倒置顯微鏡(COICXSZ-D2型)，日本尼康公司;680型酶標儀，美國Bio-Rad公司;熒光顯微鏡，日本尼康公司;流式細胞儀，美國BD公司。

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1 PC12細胞培養(yǎng) 細胞復蘇后接種于用多聚賴氨酸包被過的培養(yǎng)瓶中，用含5%胎牛血清(FBS)和10%馬血清(HS)的高糖DMEM完全培養(yǎng)基在5%CO2，37℃條件下恒溫、恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞匯合度70% ～80%時按1∶4傳代。

1.2.2 MTT檢測TSA對細胞增殖的影響 按1×104個細胞/孔、200 μl接種用多聚賴氨酸包被過的96孔板，在5%CO2、37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，換成含不同濃度TSA的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，處理 48 h 后，每孔加入5 g·L－1MTT 20 μl，再培養(yǎng)4 h，每孔加入三聯(lián)裂解液150 μl過夜，待孔內(nèi)顆粒完全溶解后，用酶標儀，選擇波長570 nm，檢測各孔吸光度(A)，抑制率%=1－A實驗組/A對照組×100%，實驗重復3次，結(jié)果做統(tǒng)計分析。

1.2.3 模型的建立及實驗分組 參考文獻方法稍加改進建立缺糖/缺氧模型，取處于對數(shù)生長期的PC12細胞按1×104個/孔、200 μl接種于用多聚賴氨酸包被過的96孔板中，在5%CO2、37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，將其分為 blank control、model control和OGD組，每組設6個復孔。OGD組設六個濃度，分別加入含 CoCl2為 25、50、100、200、400、800 μmol·L－1的無糖 DMEM 培養(yǎng)基 100 μl，37℃，5%CO2培養(yǎng)2 h，用MTT法檢測細胞存活率，確定最佳造模濃度。

1.2.4 利用PI和Hochest染色檢測細胞凋亡與壞死 取處于對數(shù)期的PC12細胞按1×105個 /孔、600 μl接種于用多聚賴氨酸包被過的24孔板，分組，細胞貼壁過夜，將各組舊培養(yǎng)基小心吸出后，用PBS洗兩遍，將其分為blank control、model control和OGD組。OGD組設3個濃度，分別加入含CoCl2為50、200、800 μmol·L－1的無糖 DMEM 培養(yǎng)基300 μl，37℃，5%CO2培養(yǎng)2 h，小心吸干上清后，用PBS洗兩遍，加入0.01 g·L－1Hoechst 33258和0.01 g·L－1PI(用PBS溶液配制成0.01 g·L－1)各100 μl，避光反應10 min吸棄上清，用PBS洗兩遍后，加入含10%FBS的PBS 200 μl，熒光顯微鏡觀察攝像。PI熒光為紅色(620 nm)，Hoechst 33258熒光為藍色(480 nm)。

1.2.5 MTT法檢測細胞存活率 按1×104個細胞/孔、200 μl接種用多聚賴氨酸包被過的96孔板，分組，將其分為control組，OGD組，給藥組。給藥組設7 個濃度，分別為:1、10、40、80、160、320、640 nmol·L－1。每組設 6個復孔，在 5%CO2、37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，將各組舊培養(yǎng)基吸出后control組加入100 μl完全培養(yǎng)基，給藥組含不同濃度TSA的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，將除control外的其他各組的舊培養(yǎng)基小心吸出后，用PBS洗兩次，OGD 組加入含 CoCl2100 μmol·L－1的無糖 DMEM培養(yǎng)基100 μl，給藥組加入含不同濃度TSA的OGD培養(yǎng)液100 μl，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，每孔加入終濃度為 5 g·L－1的 MTT 溶液 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入三聯(lián)裂解液150 μl過夜，待孔內(nèi)顆粒完全溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測儀，選擇波長570 nm，檢測各孔吸光度(A)。

1.2.6 檢測細胞內(nèi)活性氧含量

1.2.6 .1 熒光顯微鏡檢測細胞內(nèi)活性氧含量 取對數(shù)生長期的PC12細胞消化收集并接種于24孔板中，貼壁過夜。分別加藥處理，并設陽性對照組和陰性對照組。給藥組造模前提前4 h加入不同濃度TSA處理，2 h后小心吸去細胞培養(yǎng)液，每孔加入200 μl按照1 ∶1000用 PBS稀釋好的DCFH-DA，使終濃度為 10 μmol·L－1。37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用PBS洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。最后每孔加入500 μl PBS，陽性對照組加入1 μl活性氧陽性對照刺激物Rosup。20 min后用熒光顯微鏡在波長485 nm激發(fā)光下觀察。

1.2.6 .2 流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧含量 取對數(shù)生長期的PC12細胞消化收集并接種于6孔板中，貼壁過夜。分別加藥處理，并設陽性對照組和陰性對照組。給藥組造模前提前4 h加入不同濃度TSA處理，2 h后收集細胞到相應流式管中，每管加入 400 μl終濃度為 10 μmol·L－1的 DCFH-DA，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min用PBS洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。最后每孔加入500 μl PBS，陽性對照組加入1 μl活性氧陽性對照刺激物Rosup。20 min后用流式細胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 TSA對PC12細胞增殖活性的影響 隨著TSA濃度升高，細胞的增殖活性逐漸降低，從5 nmol·L－1起明顯抑制增殖活性(P＜0.05)，并在160 nmol·L－1時抑制50%的增殖活性，見Fig 1。

2.2 PC12細胞缺糖/缺氧損傷模型的建立 實驗結(jié)果表明隨著CoCl2濃度的增加細胞存活率相應下降。實驗選擇PC12細胞OGD損傷2 h，存活率為61%時 CoCl2濃度為 100 μmol·L－1作為下一步實驗造模濃度。見Fig 2。

Fig 1 Survival rate of PC12 cell with TSA for 48 h( ± s)

Fig 2 Survival rate of PC12 cell with CoCl2for 2 h(n=6)

2.3 利用PI和Hochest染色檢測細胞凋亡與壞死實驗觀察隨著CoCl2濃度的增加，與blank control相比，細胞凋亡與壞死的數(shù)量不斷增加，尤其是800 μmol·L－1CoCl2組最為明顯。結(jié)果見Fig 3。

Fig 3 Cell apoptosis and necrosis observed in PI and Hoechst staining(10×10)

2.4 TSA對缺糖/缺氧損傷的PC12細胞存活率的影響 MTT法檢測顯示，10～160 nmol·L－1TSA組全程作用6 h后，經(jīng)缺糖/缺氧損傷的PC12細胞存活率與模型組相比差異有顯著性(P＜0.05)，特別是80 nmol·L－1的TSA組與OGD組相比其存活率提高了29%。結(jié)果見Fig 4。

Fig 4 Effect of TSA on survival rate of OGD on PC12 cells( ± s)

2.5 熒光顯微鏡檢測PC12細胞活性氧的含量采用DCFH-DA熒光探針對細胞內(nèi)活性氧含量進行測定。實驗結(jié)果顯示PC12細胞經(jīng)OGD損傷2 h后，ROS生成量明顯增加;TSA全程處理的PC12細胞OGD損傷2 h后，細胞內(nèi)ROS生成量與OGD處理組比較明顯減少，特別是80 nmol·L－1TSA+OGD組。實驗結(jié)果表明TSA能夠拮抗OGD損傷造成的PC12細胞內(nèi)ROS的增加。結(jié)果見Fig 5。

Fig 5 Effect of TSA on oxygen content of active cells(10×10)

2.6 流式細胞儀檢測PC12細胞內(nèi)活性氧含量采用DCFH-DA熒光探針對細胞內(nèi)活性氧含量進行測定。流式細胞儀顯示的數(shù)據(jù)與熒光顯微鏡的結(jié)果吻合。PC12細胞經(jīng)OGD損傷2 h后，ROS生成量明顯增加，TSA全程處理的PC12細胞OGD損傷2 h后，細胞內(nèi)ROS生成量與OGD組相比較明顯減少，特別是80 nmol·L－1TSA+OGD組。由此證明80 nmol·L－1TSA+OGD能明顯拮抗OGD損傷造成的PC12細胞內(nèi)ROS的增加。結(jié)果見Fig 6。

Fig 6Effect of TSA on oxygen content of active cells(±s)

3 討論

目前認為神經(jīng)元損傷是缺血性腦血管疾病的發(fā)病機制中的重要因素，損傷涉及多方面，其包括能量代謝障礙、ROS損傷、神經(jīng)元細胞內(nèi)電解質(zhì)失衡(鈣、鈉離子超載)、脂質(zhì)過氧化反應、線粒體損傷及細胞凋亡等。［7－9］在這些諸多的損傷因素中，能量代謝障礙可能是首發(fā)環(huán)節(jié)，因此緩解細胞能量代謝障礙被認為是治療缺血性卒中的一個重要的治療靶點［10］。

實驗運用CoCl2合并無糖培養(yǎng)基模擬細胞缺血損傷過程，建立了體外神經(jīng)元的缺血模型。［11］發(fā)現(xiàn)100 μmol·L－1CoCl2合并缺糖 2 h，細胞存活率為61%，且細胞無明顯的壞死，因此適宜用此濃度建模。通過大量MTT前期實驗篩選出PC12細胞添加TSA的最佳方案，即通過TSA對PC12細胞預處理4 h，OGD過程也同時加入TSA(全程加入法)、TSA只對PC12細胞預處理4 h(預處理法)和OGD過程同時加入TSA(同時加入法)三種處理方案的MTT數(shù)據(jù)比對，發(fā)現(xiàn)全程加入法對細胞的保護效果最佳。

近期文獻報道，細胞中參與糖酵解，糖異生，三羧酸循環(huán)，尿素循環(huán)，脂肪酸循環(huán)，糖原代謝中的多種酶都會被乙?；揎棧⑶壹毎饽芰课镔|(zhì)的濃度將直接影響這些代謝過程中酶的乙?；潭龋?2，13］。然而近期有文章指出，許多參與糖酵解和脂肪代謝的酶的乙?；潭戎苯佑绊懫浠钚裕阴；潭雀?，則酶活性強。已經(jīng)證實:GADPH的乙?；铀偬墙徒獾姆磻黾酉?COA水合酶和3-L-羥脂酰-COA的乙?；揭泊龠M脂肪代謝，最終產(chǎn)生AC-COA，進入三羧酸循環(huán)(TCA)產(chǎn)生的NADH，F(xiàn)ADH2再進行氧化磷酸化反應產(chǎn)生大量 ATP［10］。MTT結(jié)果顯示，與 OGD組相比，80 nmol·L－1TSA預處理PC12細胞4 h可明顯提高細胞的存活率。由于TSA處理時間較短(4 h)，因此有可能是通過增加能量代謝過程中一些關鍵酶的乙?；揎?，從而增加或維持細胞內(nèi)能量的釋放，以應對因OGD引起的能量代謝障礙，進而提高細胞的存活率，達到保護細胞的作用。

腦缺血造成的能量代謝障礙將促使細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，它們與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、及核酸發(fā)生反應引起膜脂質(zhì)過氧化，導致膜損傷，線粒體功能障礙，細胞溶解和組織水腫等一系列損害作用［8］。研究結(jié)果顯示80 nmol·L－1TSA預保護組的胞內(nèi)ROS生成量明顯下降。因此，TSA對OGD損傷PC12細胞的保護作用，可能通過增加能量代謝酶的乙酰化水平，緩解缺血引起的能量障礙，進而降低細胞OGD損傷引起的ROS生成量，但具體的調(diào)控機制還有待進一步研究。

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