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    枸杞多糖對NMDA致大鼠視網(wǎng)膜損傷保護作用的研究

    2013-12-07 05:37:48杜瑛培戴貴東
    中國藥理學通報 2013年5期
    關鍵詞:一氧化氮神經(jīng)節(jié)枸杞

    白 雙,于 鑫,杜瑛培,鄭 萍,2,鄭 婕,2,閆 琳,2,戴貴東

    (1.寧夏醫(yī)科大學藥學院2.寧夏回藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心3.寧夏醫(yī)藥研究所;寧夏銀川 750004)

    枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide,LBP)是從寧夏特色回藥材枸杞的干燥成熟果實中提取所得。已有文獻報道[1-3],枸杞多糖具有抗氧化、防衰老、抗輻射等多種生物學活性,尤其是對急性眼高壓、糖尿病眼病等視網(wǎng)膜損傷具有保護作用。本實驗旨在通過建立NMDA致大鼠視網(wǎng)膜損傷動物模型,研究枸杞多糖的保護作用及可能機制,為臨床視網(wǎng)膜損傷疾病防治提供實驗依據(jù)。

    1 材料

    1.1 動物 清潔級♂Sprague-Dawley大鼠,7~8周齡,體質(zhì)量120~150 g,由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供,動物合格證號:SCXK(寧)2012-0006

    1.2 藥品與試劑 枸杞多糖購自寧夏沃福百瑞生物食品有限公司,含量≥30.0%,批號:64WFBR100501;戊巴比妥鈉、NMDA、氯化鈉、多聚甲醛均購自Sigma公司;凱基全蛋白提取試劑盒、凱基BCA蛋白含量檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;兔抗大鼠eNOS、iNOS抗體購自Abcam公司;兔抗大鼠NMDAR2A抗體、兔抗β-actin抗體購自Cell Signaling公司;山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate購自Thermo Scientific公司;實驗用水為超純水。

    1.3 儀器 TY96-ⅡN型超生細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司);H1850R型臺式高速冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司);5 μl微量注射器(上海安亭微量進樣器廠);Mutiskan Go酶標儀(美國Thermo Fisher公司);PowerPac Basic電泳儀(美國BIO-RAD公司);培清JS-860B凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)。

    2 方法

    2.1 實驗動物分組及模型的建立 56只清潔級♂Sprague-Dawley大鼠隨機分為4組:NMDA組、NMDA+枸杞多糖(100、200 和400 mg·kg-1)組,每組14只大鼠。NMDA組大鼠的左眼為正常對照組。NMDA致大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元損傷模型,根據(jù)Kawasaki等采用的方法略為改進[4],具體方法:各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg·kg-1麻醉,采用微量注射器大鼠右眼玻璃體內(nèi)注射2 μl濃度為40 nmol·L-1的 NMDA。枸杞多糖分別按100、200和400 mg·kg-1于NMDA注射前7天灌胃給藥,共14 d。模型組給予等體積生理鹽水。d14處死各組大鼠。每組取5只大鼠眼球剔除玻璃體縱切后浸入4%多聚甲醛固定,其余大鼠眼球剔除玻璃體后置液氮中速凍后放-80℃冰箱中凍存。

    2.2 病理學組織觀察 多聚甲醛固定24 h后,用流水沖洗3 h,然后梯度乙醇脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片和蘇木精-伊紅(HE)染色處理,每張切片隨機選取視神經(jīng)根部周圍5個圓形視野,于顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層厚度并對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層的神經(jīng)元進行計數(shù)。計數(shù)方法:同一倍率下,記錄視野中神經(jīng)節(jié)細胞層長為100 μm(長度以標尺為準,平行于神經(jīng)節(jié)細胞層方向)的任意區(qū)域內(nèi)神經(jīng)元個數(shù),取平均值。

    2.3 Western blot檢測 在約100 mg經(jīng)液氮研磨的視網(wǎng)膜組織中加入0.5 ml冷裂解緩沖液,冰浴下超聲破碎細胞。4℃,10 000 r·min-1離心 10 min,取上清蛋白定量,剩余上清加入上樣緩沖液100℃水浴10 min,-20℃保存。取蛋白樣本75 μg上樣,7.5%SDS-PAGE凝膠電泳(80V/120V電壓),200 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜,5%脫脂奶粉封閉1 h后,分別用抗NMDAR2A抗體(1∶200)、抗eNOS抗體(1∶200)、抗iNOS抗體(1∶200)及抗βactin抗體(內(nèi)參,1∶1 000)4℃孵育過夜。加入山羊抗兔二抗(偶聯(lián)有HRP,1∶4 000)常溫孵育2 h,加入超級化學發(fā)光底物反應液,曝光膠片。膠片掃描結(jié)果采用Quantity-one軟件分析,將目的條帶的光密度值與其相對應的內(nèi)參β-actin的光密度值相比以校正誤差,所得比值代表該目的蛋白的相對含量。2.4統(tǒng)計學處理實驗結(jié)果以±s表示。用SPSS 19.0軟件包進行統(tǒng)計分析。多組間均數(shù)的比較采用One-way ANOVA分析。

    Fig 1 Effect of LBP on retinal damage in NMDA treated rats

    3 結(jié)果

    3.1 視網(wǎng)膜組織學改變 光鏡下正常對照組大鼠視網(wǎng)膜HE染色后各層組織結(jié)構(gòu)清晰,完整,染色均勻,清晰可見3個核層。由內(nèi)向外依次為神經(jīng)節(jié)細胞層(GCL),內(nèi)核層(INL)以及外核層(ONL)。神經(jīng)節(jié)細胞呈單層排列,細胞大小不一,呈圓形或橢圓形,INL及ONL細胞呈多層分布,內(nèi)叢狀層(IPL)位于GCL與INL之間,外叢狀層(OPL)位于INL與ONL之間。NMDA組以GCL和IPL損傷最為明顯,神經(jīng)節(jié)細胞減少,胞內(nèi)空泡樣變性,核固縮濃染,IPL變薄。枸杞多糖(100、200和400 mg·kg-1)均能抑制NMDA所致神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡和IPL的變薄。高劑量枸杞多糖(400 mg·kg-1)對正常視網(wǎng)膜無影響(Fig 1)。

    3.2 視網(wǎng)膜NMDAR2A的表達 Western blot檢測結(jié)果顯示,正常對照組視網(wǎng)膜組織NMDAR2A蛋白表達較低。玻璃體內(nèi)注射NMDA后,NMDAR2A的蛋白表達明顯增高(P<0.01)。枸杞多糖(100、200 和 400 mg·kg-1)明 顯 降 低 NMDA 所 致NMDAR2A的蛋白表達增多(P<0.01),并且NMDA+LBP 200和400 mg·kg-1組使 NMDAR2A的表達基本降到正常水平。高劑量枸杞多糖(400 mg·kg-1)對正常視網(wǎng)膜NMDAR2A的蛋白表達無影響(Fig 2)。

    Fig 2 Effect of LBP on expression of NMDAR2A in NMDA treated rats

    3.3 視網(wǎng)膜eNOS和iNOS的表達 Western blot檢測結(jié)果顯示,與正常對照組比較,NMDA組eNOS的表達明顯降低(P<0.01)。枸杞多糖(100、200和400 mg·kg-1)可明顯抑制NMDA致eNOS表達的減少(P<0.01)。高劑量枸杞多糖(400 mg·kg-1)對正常視網(wǎng)膜 eNOS蛋白表達無影響(Fig 3B)。正常對照組視網(wǎng)膜組織中iNOS幾乎不表達。玻璃體內(nèi)注射NMDA后,視網(wǎng)膜iNOS蛋白表達明顯增高(P<0.01)。枸杞多糖(100、200和400 mg·kg-1)可明顯抑制NMDA致iNOS表達的增多(P<0.01)。高劑量枸杞多糖(400 mg·kg-1)對正常視網(wǎng)膜iNOS蛋白表達無誘導作用(Fig 3C)。

    4 討論

    本實驗研究了枸杞多糖對NMDA致大鼠視網(wǎng)膜損傷的保護作用及其機制。研究結(jié)果顯示,大鼠眼玻璃體內(nèi)注射NMDA后,視網(wǎng)膜的厚度變薄,細胞數(shù)量減少,細胞層次減少,而其中尤以神經(jīng)節(jié)細胞層(GCL)和內(nèi)叢狀層(IPL)損傷最為明顯,神經(jīng)節(jié)細胞明顯減少,胞內(nèi)空泡樣變性,核固縮濃染,IPL明顯變薄,這與Mori等研究報道一致[5]。枸杞多糖可以減輕視網(wǎng)膜病理損傷,以200、400 mg·kg-1給藥最為明顯。提示,枸杞多糖對NMDA誘導的大鼠視網(wǎng)膜損傷有保護作用。

    Fig 3 Effect of LBP on expression of eNOS and iNOS in NMDA treated rats

    興奮性氨基酸對視網(wǎng)膜內(nèi)層細胞具有毒性作用。大量文獻報道,NMDA激動其受體介導的興奮性毒性與視網(wǎng)膜缺血和青光眼等多種眼部疾病有關[6-7]。NMDA 受體至少有五個亞基:NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、NMDAR2C、NMDAR2D。其中NMDAR1是NMDA受體一個基本亞基,沒有它受體將沒有功能。NMDAR2A~D亞基可能是調(diào)節(jié)亞基[8]。NMDAR1在視網(wǎng)膜的興奮性毒性損傷中不發(fā)揮作用,而NMDAR2A與氨基酸興奮性毒性損傷機制有關[9]。本實驗研究結(jié)果顯示,NMDA可誘導大鼠視網(wǎng)膜組織NMDAR2A蛋白表達增加,這與Matteucci等[10]研究報道相一致。枸杞多糖干預后可使大鼠視網(wǎng)膜組織NMDAR2A表達降低,提示,枸杞多糖可抑制大鼠視網(wǎng)膜組織中NMDAR2A表達的上調(diào)。

    越來越多的證據(jù)表明,一氧化氮在視網(wǎng)膜的生理性修復及病理過程中發(fā)揮重要作用[11]。一氧化氮由L-精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)作用下生成。NOS包括:神經(jīng)型(nNOS)、內(nèi)皮型(eNOS)和誘導型(iNOS)3種。nNOS和eNOS為結(jié)構(gòu)型,在正常視網(wǎng)膜細胞中表達,催化生成生理量的一氧化氮,對視網(wǎng)膜產(chǎn)生保護作用,在視網(wǎng)膜損傷時,表達下降。iNOS為誘導型,正常情況下不表達,在視網(wǎng)膜受各種病理損傷性刺激后大量表達,導致大量具有自由基毒性作用一氧化氮過量的生成,對視網(wǎng)膜產(chǎn)生損傷作用[12]。NMDA受體激活后,可開放電壓門控性鈣通道引起鈣離子內(nèi)流,激活鈣離子敏感的酶,其中包括iNOS表達的增加。同時鈣離子升高誘導產(chǎn)生大量超氧陰離子并與一氧化氮結(jié)合,生成過氧亞硝酸基,誘導神經(jīng)節(jié)細胞凋亡[13]。本實驗研究發(fā)現(xiàn),NMDA玻璃體注射的大鼠視網(wǎng)膜組織中eNOS蛋白表達下降,iNOS蛋白表達明顯增加,這與Nakamichi等研究報道一致[14]。不同劑量枸杞多糖給藥后,尤其高劑量枸杞多糖可以有效的逆轉(zhuǎn)由NMDA誘導損傷的大鼠視網(wǎng)膜組織中eNOS表達下調(diào)和iNOS表達的上升。提示,枸杞多糖對由NMDA誘導的大鼠視網(wǎng)膜損傷保護作用的機制與抑制eNOS/iNOS異常表達有關。

    綜上所述,枸杞多糖對NMDA致大鼠視網(wǎng)膜損傷具有保護作用,其機制與調(diào)控視網(wǎng)膜NMDAR2A表達以及eNOS/iNOS水平有關。由于視網(wǎng)膜病變存在多種發(fā)生機制[15],枸杞多糖對視網(wǎng)膜病變的保護是否通過其他作用靶點,尚需進一步研究。

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