5-LO表達(dá)對(duì)鋁鹽致海馬神經(jīng)元損傷的影響

王健峰，楊俊卿，黃 硯，謝靈瑤，郭遠(yuǎn)新，雷文娟

(重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶 400016)

5-LO(5-lipoxygenase，5-LO)是機(jī)體內(nèi)催化花生四烯酸(AA)生成白三烯(LTs)的關(guān)鍵酶，白三烯作為重要的炎癥介質(zhì)，參與了各種炎癥反應(yīng)的病理生理過程。5-LO在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，尤其是在小腦和海馬中表達(dá)較為明顯，并與腦損傷和神經(jīng)元退行性疾病如阿爾采末病等密切相關(guān)。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)_，側(cè)腦室注射給鋁和慢性灌胃給鋁神經(jīng)元5-LO mRNA和蛋白表達(dá)增加，給予5-LO抑制劑咖啡酸對(duì)鋁鹽致神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用［1－3］。為了進(jìn)一步研究5-LO表達(dá)在神經(jīng)元損傷中的意義，我們將5-LO過表達(dá)重組體腺病毒(Ad5-LO)及5-LO RNAi重組體腺病毒(Ad5-LO-RNAi)轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，觀察5-LO的表達(dá)對(duì)鋁鹽負(fù)荷致海馬神經(jīng)元損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 新生24 h的SD大鼠，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(渝)20070001］。293細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)系提供。5-LO過表達(dá)重組體腺病毒及5-LO RNAi重組體腺病毒均由美國芝加哥大學(xué)骨科腫瘤分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。DMEM/F12、B27，均購于美國 Gibco公司;特級(jí)胎牛血清，購于天津?yàn)柟?青霉素(80萬U)、鏈霉素(100萬U)，均購于華北制藥股份有限公司;多聚-L-賴氨酸、噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒、1×Tris-甘氨酸緩沖液、電轉(zhuǎn)移緩沖液，均購于美國Sigma公司;乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所;RT-PCR試劑盒，購于TaKaRa公司;PCR MIX染料，購于廣東東盛科技公司;RIPA細(xì)胞裂解液，購于北京百泰克生物技術(shù)有限公司;5-LO一抗(羊多抗5-LO)，購于美國Santa Cruz公司;5-LO二抗、SDS-PAGE凝膠試劑盒、蛋白定量試劑盒，均購于北京博奧森公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，購于美國Pierce公司;六水三氯化鋁(AlCl3·6H2O)、氯化鈉(NaCl)均為國產(chǎn)分析純;PCR引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)及分組［2，10］取新生24 h內(nèi)的SD大鼠，以體積分?jǐn)?shù)為0.75的乙醇全身消毒后，斷頭取腦，分離雙側(cè)海馬。海馬組織于冰浴的D-Hanks液中，剪碎約0.1 mm3。加入適量的質(zhì)量濃度為1.25 g·L－1的胰酶，于37℃的 CO2培養(yǎng)箱中消化20～30 min，每10 min輕輕搖勻1次。加入含體積分?jǐn)?shù)為0.20胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化。吹打成細(xì)胞懸液后，200目細(xì)胞篩過濾。取細(xì)胞懸液800 r·min－1離心8 min，去上清，重復(fù)離心2次。用含體積分?jǐn)?shù)為0.20胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1×109細(xì)胞·L－1，分別接種于已用 0.05 g·L－1多聚-L-賴氨酸預(yù)處理的細(xì)胞培養(yǎng)板或細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后，換成含體積分?jǐn)?shù)為0.02的B27的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每3天半換液1次，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)采用培養(yǎng)7 d的神經(jīng)元。

實(shí)驗(yàn)共分為7組:空白對(duì)照組(NaCl 200 μmol·L－1)、空載腺病毒組(MOI=100)、5-LO過表達(dá)腺病毒組(MOI=100)、5-LO RNAi腺病毒組(MOI=100)、空載腺病毒(MOI=100)+鋁鹽負(fù)荷組(AlCl3200 μmol·L－1)、5-LO 過表達(dá)腺病毒(MOI=100)+鋁鹽負(fù)荷組(AlCl3200 μmol·L－1)、5-LO RNAi腺病毒(MOI=100)+鋁鹽負(fù)荷組 (AlCl3200 μmol·L－1)。

1.2.2 腺病毒的擴(kuò)增與滴度測定［4］293細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)至融合后，加入1.5 μl腺病毒原液，于37℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞病理效應(yīng)時(shí)，收集細(xì)胞沉淀，加入 0.5 ml完全培養(yǎng)液，于 37℃和－80℃反復(fù)凍融4 次。4℃，8 000 r·min－1，離心15 min，收集上清即為腺病毒擴(kuò)增液。將細(xì)胞密度為108cells·L－1的293細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每孔90 μl，培養(yǎng)24 h。每12個(gè)孔為1組，第1孔加入10 μl待測腺病毒液，混勻后依次取10 μl做10∶1倍比稀釋并加入后1孔，棄去倒數(shù)第2孔中吸出的10 μl培養(yǎng)液，最后1孔做陰性對(duì)照。培養(yǎng)24 h后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光細(xì)胞數(shù)量，未觀察到熒光的細(xì)胞(上1孔熒光細(xì)胞數(shù)≥5)孔為計(jì)數(shù)孔(計(jì)為1U)。病毒滴度=1U×計(jì)數(shù)孔相對(duì)于第1孔的稀釋倍數(shù)/第1孔加入病毒的體積，即1×10(n+1)kU·L－1，n= 計(jì)數(shù)孔。

1.2.3 海馬神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)觀察 24孔培養(yǎng)板內(nèi)接種于蓋玻片上的培養(yǎng)7 d的海馬神經(jīng)元，藥物處理及分組同“1.2”方法。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，攝片。

1.2.4 MTT法測定細(xì)胞存活率 96孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)7 d的海馬神經(jīng)元，藥物處理及分組同“1.2”方法。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入 MTT溶液20 μl(終濃度為5 g·L－1)，37℃的CO2培養(yǎng)箱孵育4 h后吸去培養(yǎng)液。每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，避光震搖以溶解結(jié)晶。酶標(biāo)儀于570 nm處測定每孔OD值。

1.2.5 乳酸脫氫酶(LDH)漏出率測定 24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)7 d的海馬神經(jīng)元，如上分組處理。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按照LDH檢測試劑盒說明書于440 nm處測定LDH的OD值。蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測定，具體操作按照說明書進(jìn)行。

1.2.6 測定SOD活性和MDA含量 24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)7 d的海馬神經(jīng)元，如上分組處理。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按照SOD活性檢測試劑盒說明書及MDA含量檢測試劑盒說明書操作，分別于550 nm和532 nm處分別檢測SOD和MDA的OD值。蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測定，具體操作按照說明書進(jìn)行。

1.2.7 RT-PCR檢測海馬神經(jīng)元5-LO mRNA的表達(dá) 培養(yǎng)7 d的海馬神經(jīng)元，如上分組處理。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按說明書提取總RNA，測定濃度并分裝。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR所用引物為:5-LO(5'-TGTACCCAGAGGAGCAT-3'，5'-ACGGCAAAGCCTTAGAT-3'，PCR產(chǎn)物長度為 177 bp);β-actin(5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，5'-GTGCTAGGAGCCAGGGCAGTA-3'，PCR 產(chǎn) 物 長度為358 bp)。反應(yīng)條件為94.0℃ 3 min，94.0℃ 30 s，55.0℃ 30 s，72.0℃ 40 s，72.0℃ 5 min，共計(jì) 35循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用Bio-Rad成像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。

1.2.8 Western blot檢測海馬神經(jīng)元5-LO蛋白的表達(dá) 培養(yǎng)7 d的海馬神經(jīng)元，如上分組處理。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白含量。等量蛋白上樣進(jìn)行SDSPAGE電泳。常規(guī)轉(zhuǎn)膜。50 g·L－1的脫脂奶粉封閉1 h;加一抗，37℃振搖孵育2 h;充分洗膜后，加二抗，37℃振搖孵育2 h。TBST洗3 min×3次。ECL化學(xué)發(fā)光。

Fig 1 Effect of 5-LO expression on pathomorphology in primarily cultured rat hippocampal neurons(Fluorescence microscope，×200)

2 結(jié)果

2.1 腺病毒滴度 測得空載腺病毒滴度=109kU·L－1;5-LO過表達(dá)腺病毒滴度=109kU·L－1;5-LO RNAi腺病毒滴度=109U·L－1。根據(jù)公式計(jì)算轉(zhuǎn)染神經(jīng)元需要加入的病毒量:MOI=病毒滴度×V(需加入的病毒液體積)/神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)，即當(dāng)MOI=100 時(shí)，V=100 μl。

2.2 海馬神經(jīng)元病理形態(tài) 空載腺病毒組、5-LO過表達(dá)腺病毒組和5-LO RNAi腺病毒組海馬神經(jīng)元胞體飽滿，突觸結(jié)構(gòu)完整清晰;空載腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，胞體萎縮，突觸變短，可見細(xì)胞碎片。與空載腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組比較，5-LO過表達(dá)腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組神經(jīng)元數(shù)目減少更為明顯，胞體萎縮，突起減少變短，細(xì)胞碎片明顯增多;5-LO RNAi腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組神經(jīng)元數(shù)目明顯增多，細(xì)胞形態(tài)飽滿，突起結(jié)構(gòu)完整清晰并部分連接成網(wǎng)(Fig 1)。

Tab 1 Effect of 5-LO expression on MTT value in primarily cultured rat hippocampal neurons(±s，n=6)

Tab 1 Effect of 5-LO expression on MTT value in primarily cultured rat hippocampal neurons(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs Adenovirus-treated group;#P＜0.05 vs Adenovirus+Aluminum-treated group

Group OD Control 0.764 ±0.071 Adenovirus-treated 0.779 ±0.077 Ad5-LO-treated 0.760 ±0.056 Ad5-LO-RNAi-treated 0.740 ±0.122 Adenovirus+Aluminum-treated 0.508 ±0.063＊＊Ad5-LO+Aluminum-treated 0.420 ±0.073#Ad5-LO-RNAi+Aluminum-treated 0.581 ±0.042#

2.3 海馬神經(jīng)元存活率 由Tab 1所示，與空白對(duì)照組比較，空載腺病毒組、5-LO過表達(dá)腺病毒組及5-LO RNAi腺病毒組MTT值無明顯差異。與空載腺病毒組比較，空載腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組MTT值明顯降低，差異有顯著性(P＜0.01)。與空載腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組比較，5-LO過表達(dá)腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組MTT值降低更明顯;5-LO RNAi腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組MTT值明顯升高，差異有顯著性(Tab 1)。

2.4 海馬神經(jīng)元LDH漏出率 由Tab 2所示，與空白對(duì)照組比較，空載腺病毒組、5-LO過表達(dá)腺病毒組及5-LO RNAi腺病毒組LDH漏出率無明顯差異。與空載腺病毒組比較，空載腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組LDH漏出率明顯增加，差異有顯著性(P＜0.01)。與空載腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組比較，5-LO過表達(dá)腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組LDH漏出率增加更明顯;5-LO RNAi腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組LDH漏出率明顯降低，差異有顯著性(Tab 2)。

Tab 2 Effect of 5-LO expression on LDH leakage in primarily cultured rat hippocampal neurons(±s，n=6)

Tab 2 Effect of 5-LO expression on LDH leakage in primarily cultured rat hippocampal neurons(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs Adenovirus-treated group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs Adenovirus+Aluminum-treated group.

Group Leakage of LDH/%Control 17.93 ±2.98 Adenovirus-treated 18.03 ±3.81 Ad5-LO-treated 18.65 ±4.11 Ad5-LO-RNAi-treated 19.02 ±3.06 Adenovirus+Aluminum-treated 39.68 ±4.82＊＊Ad5-LO+Aluminum-treated 48.07 ±5.17#Ad5-LO-RNAi+Aluminum-treated 23.73 ±5.61##

2.5 海馬神經(jīng)元SOD活性和MDA含量 由Tab 3所示，與空白對(duì)照組比較，空載腺病毒組、5-LO過表達(dá)腺病毒組及5-LO RNAi腺病毒組SOD活性和MDA含量無明顯變化。與空載腺病毒組比較，空載腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增加。與空載腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組比較，5-LO過表達(dá)腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組SOD活性降低和MDA含量增加更明顯;5-LO RNAi腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低(Tab 3)。

Tab 3 Effect of 5-LO expression on SOD activity and MDA content in primarily cultured rat hippocampal neurons( ± s，n=6)

Tab 3 Effect of 5-LO expression on SOD activity and MDA content in primarily cultured rat hippocampal neurons( ± s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs Adenovirus-treated group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs Adenovirus+Aluminum-treated group

Group SOD/kU·g－1Pro MDA/μmol·g－1Pro Control 86.28 ±5.90 2.25 ±0.55 Adenovirus-treated 83.83 ±6.00 2.20 ±0.45 Ad5-LO-treated 82.53 ±3.51 2.25 ±0.39 Ad5-LO-RNAi-treated 83.75 ±4.91 2.74 ±0.29 Adenovirus+Aluminum-treated 46.38 ±4.04＊＊ 4.20 ±0.59＊＊Ad5-LO+Aluminum-treated 40.48 ±2.28# 5.10 ±0.33#Ad5-LO-RNAi+Aluminum-treated 71.73 ±3.77## 3.22 ±0.28#

2.6 海馬神經(jīng)元5-LO mRNA的表達(dá) 結(jié)果顯示，空載腺病毒組與空白對(duì)照組無明顯差異。與空載腺病毒組比較，5-LO過表達(dá)腺病毒組和空載腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組5-LO mRNA表達(dá)均明顯升高;5-LO RNAi腺病毒組5-LO mRNA表達(dá)明顯降低，差異有顯著性。與空載腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組比較，5-LO過表達(dá)腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組5-LO mRNA表達(dá)升高更為明顯;5-LO RNAi腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組5-LO mRNA表達(dá)明顯降低，差異有顯著性(Fig 2～5)。

Fig 2 Change of 5-LO mRNA expression in primarily cultured rat hippocampal neurons

Fig 3 Change of 5-LO mRNA expression in primarily cultured rat hippocampal neurons

Fig 4 Change of 5-LO mRNA expression in primarily cultured rat hippocampal neurons

Fig 5 Change of 5-LO mRNA expression in primarily cultured rat hippocampal neurons

2.7 海馬神經(jīng)元5-LO蛋白的表達(dá) 結(jié)果顯示，空載腺病毒組與空白對(duì)照組5-LO蛋白表達(dá)無明顯差異。與空載腺病毒組比較，5-LO過表達(dá)腺病毒組和空載腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組5-LO蛋白表達(dá)均明顯升高;5-LO RNAi腺病毒組5-LO蛋白表達(dá)明顯降低，差異有顯著性。與與空載腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組比較，5-LO過

表達(dá)+鋁鹽負(fù)荷組5-LO蛋白表達(dá)升高更為明顯;5-LO RNAi+鋁鹽負(fù)荷組5-LO蛋白表達(dá)明顯降低，差異有顯著性(Fig 6～9)。

Fig 6 Change of 5-LO protein expression in primarily cultured rat hippocampal neurons

Fig 7 Change of 5-LO protein expression in primarily cultured rat hippocampal neurons

Fig 8 Change of 5-LO protein expression in primarily cultured rat hippocampal neurons

3 討論

海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，主要參與學(xué)習(xí)記憶、情緒等功能的調(diào)節(jié)，且容易受到外傷、缺血、缺氧等疾病因素的影響。原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元具有影響因素單一、機(jī)體干擾因素少、結(jié)果易于分析等優(yōu)點(diǎn)，是從細(xì)胞和分子水平研究海馬神經(jīng)元損傷的理想模型。

Fig 9 Change of 5-LO protein expression in primarily cultured rat hippocampal neurons

本實(shí)驗(yàn)用含2%B27的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)，神經(jīng)元生長良好。培養(yǎng)至d 7，將重組體腺病毒轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單純的5-LO過表達(dá)并不引起海馬神經(jīng)元的損傷。與空載腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組比較，5-LO過表達(dá)腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組神經(jīng)元數(shù)目更為減少，MTT值亦明顯降低，LDH漏出率和5-LO mRNA和蛋白表達(dá)增多也更為明顯，說明5-LO過表達(dá)加鋁鹽負(fù)荷加重了鋁鹽負(fù)荷對(duì)海馬神經(jīng)元的損傷作用。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，單純的抑制5-LO表達(dá)，對(duì)海馬神經(jīng)元沒有明顯的影響，而5-LO RNA干涉能明顯降低鋁鹽負(fù)荷所導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷。與我們的研究結(jié)果類似，Jones等［5］也發(fā)現(xiàn)單純的5-LO過表達(dá)不引起肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生，而5-LO過表達(dá)的同時(shí)給予野百合堿處理卻能促進(jìn)野百合堿所導(dǎo)致的肺動(dòng)脈高壓的形成，給予5-LO抑制劑MK-886后能夠明顯改善野百合堿所致的肺動(dòng)脈高壓現(xiàn)象。因此，5-LO的過表達(dá)能夠增強(qiáng)海馬神經(jīng)元對(duì)鋁的易感性，加重?fù)p傷作用，而抑制5-LO的表達(dá)能夠抑制該現(xiàn)象的發(fā)生。

已有研究發(fā)現(xiàn)，鋁能夠增強(qiáng)活性氧類(ROS)自由基的生成和脂質(zhì)過氧化過程，大量自由基的產(chǎn)生通過激活5-LO，最終造成神經(jīng)元的損傷［6-9］。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)單純5-LO過表達(dá)組SOD活性和MDA含量無明顯變化。單純鋁鹽負(fù)荷組SOD活性降低，MDA含量顯增多。與空載腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組比較，5-LO過表達(dá)腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組SOD活性降低更為明顯，MDA含量增多更為明顯;而5-LO RNAi腺病毒+鋁鹽負(fù)荷組SOD活性升高，MDA含量減少。研究結(jié)果進(jìn)一步證明鋁鹽負(fù)荷所致神經(jīng)元損傷機(jī)制與5-LO介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。

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