利用基因芯片篩選藜蘆定堿對SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性相關(guān)基因

王艷麗，王宇光 ，梁乾德，馬增春，肖成榮，譚洪玲，湯響林，張伯禮，高 月

(1.解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所藥理毒理研究室，北京 100850;3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

藜蘆為百合科藜蘆屬植物，根及根莖入藥，有大毒。藜蘆所含化學(xué)成分中有多種甾體生物堿。據(jù)報道，藜蘆生物堿可以作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，使大腦先興奮后抑制，出現(xiàn)意識障礙癥狀如痙攣、抽搐以及昏睡昏迷［1］等。已有研究顯示藜蘆生物堿是鈉通道失活門的抑制劑，浸浴藜蘆生物堿可使大鼠初級感覺神經(jīng)元產(chǎn)生一種可能與觸發(fā)痛的發(fā)作有關(guān)的觸發(fā)性振蕩［2］。小劑量的藜蘆生物堿具有一定的降壓作用，而劑量較大時能使分離的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高，成為一種脂溶性神經(jīng)毒素［3］。

以往的研究多集中于藜蘆對神經(jīng)細(xì)胞離子通道或電生理的影響及其與神經(jīng)毒性的關(guān)系，但其對神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響尚未見文獻(xiàn)報道。藜蘆定堿有可能通過改變神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)信號通路，造成亞急性或慢性損傷。

SH-SY5Y細(xì)胞系來源于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，形態(tài)及生理生化功能與正常神經(jīng)元相似，是目前國際上研究神經(jīng)系統(tǒng)功能公認(rèn)的一種細(xì)胞模型［4］，常用于神經(jīng)毒性、帕金森病、阿爾采末?。?］等的研究。

基因芯片技術(shù)可代替?zhèn)鹘y(tǒng)的動物毒理學(xué)實驗進(jìn)行早期的毒性篩查和線索發(fā)現(xiàn)，其最顯著的特點是在毒性線索發(fā)現(xiàn)階段可以給出海量的信息［6］，有助于更深入的毒性機制研究。從基因組水平上研究藜蘆定堿與相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)系，通過基因表達(dá)圖譜改變發(fā)現(xiàn)藜蘆定堿的毒性作用機制不失為一種有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 SH-SY5Y細(xì)胞購買于協(xié)和細(xì)胞中心。

1.1.2 實驗藥物 藜蘆定堿(veratridine，批號:D00114760)購自Merck公司。

1.1.3 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基(批號:C11875500BT)由Gibco BRL公司提供，新生胎牛血清(FBS，批號:NXF0650)和0.25%胰蛋白酶(批號:SLBC1656)購自 Hyclone公司，TRIzol(批號:15596018)購自Invitrogen公司;基因芯片檢測試劑盒Amino Allyl Message AmpTMⅡaRNA Amplification Kit(Ambion#AM1753，CA，USA);HOA 5.1基因芯片 (Phalanx Biotech Group，Inc，Taiwan)。

1.1.4 儀器與軟件 CO2培氧箱(Thromeo公司)，倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠);圖像掃描儀AX-ON4000B(Molecular Device，CA，USA);數(shù)據(jù)處理軟件 Rosetta Resolver?System(Rosetta Biosoftware，USA)。

1.2 方法

1.2.1 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)、處理和收集 將 SHSY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640(含15%滅活FBS，100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)，37℃、5%CO2孵育，2～3 d換液，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。將藜蘆定堿分別以終濃度為50，200，800 μmol·L－1加入SH-SY5Y細(xì)胞中，分別標(biāo)記為低濃度(L)組、中濃度(M)組、高濃度(H)組;另外設(shè)置正常對照組加空白培養(yǎng)液，標(biāo)記為N組，加藥作用8 h。

1.2.2 電泳檢測 RNA品質(zhì) TRizol法提取 SHSY5Y細(xì)胞的總RNA，將純化的總RNA樣品置于70℃水浴保溫1 h，各取5 μl用 RNase-free Water稀釋50倍，用甲醛變性膠電泳檢測提取的RNA純度，觀察18和28 s rRNA條帶的強弱和有無拖尾現(xiàn)象，同時計算兩條帶的灰度比，并在220～320 nm紫外波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，定量［7］。

1.2.3 cDNA的合成及其探針標(biāo)記 使用基因芯片檢測試劑盒 Amino AllylMessageAmpTMⅡ aRNA Amplification Kit(Ambion#AM1753，CA，USA)進(jìn)RNA反轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞外轉(zhuǎn)錄放大與標(biāo)記。以1 μg總RNA起始反轉(zhuǎn)錄為cDNA探針，熒光染料Cy5接dUTP上，在細(xì)胞外轉(zhuǎn)錄放大同時摻入進(jìn)行標(biāo)記成為Cy5 標(biāo)記的 aRNA［8］。

1.2.4 基因芯片雜交與洗滌 取10 μg Cy5標(biāo)記的aRNA，以試劑盒Ambion#AM8740進(jìn)行片段化后，加入120 μl的1.5倍OneArray雜交液中?；蛐酒?HOA 5.1(Phalanx Biotech Group，Inc，Taiwan)以100%無水酒精進(jìn)行變性20 s后加入OneArray?預(yù)雜交緩沖液 (5x SSPE，0.1%SDS，1%BSA)于42℃靜置2 h完成芯片預(yù)雜交。將已片段化的Cy5-aRNA加入1.5 x OneArray?雜交緩沖液至總反應(yīng)體積180 μl于95℃反應(yīng)5 min變性后，加入已完成預(yù)雜交的芯片，50℃反應(yīng)16 h。完成雜交后以清洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(清洗液I:2x SSC+0.2%SDS;清洗液Ⅱ:2x SSC;清洗液Ⅲ:0.2x SSC)分別于42℃，42℃，25℃清洗 5，5 min，5 s 后甩干［9］。

1.2.5 圖像掃描與數(shù)據(jù)處理 用 AXON4000B(Molecular Device，CA，USA)掃描儀掃描雜交后芯片，利用GenePixTM4提取基因表達(dá)的熒光信號強度值擷取，獲得初級數(shù)據(jù)格式gpr檔案為原始數(shù)據(jù)。將gpr導(dǎo)入 Rosetta Resolver?System(Rosetta Biosoftware，USA)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)前處理與均一化，剔除在所有芯片中flag值皆為-50的探針后，對三樣本重復(fù)進(jìn)行median scaling校正后的均值，即為每一樣本均一化后的訊號值。接下來套用Rosetta Resolver的error model計算兩兩實驗樣本間的Cy5熒光訊號的log2比值及P-value。挑選|log2比值|≥1P-value＜0.05的基因為顯著差異表達(dá)基因。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)變化 SH-SY5Y細(xì)胞受藜蘆定堿作用后細(xì)胞體積收縮、變圓，樹突數(shù)量減少，細(xì)胞連接明顯減少，細(xì)胞增殖率降低，高劑量組出現(xiàn)細(xì)胞體積收縮、變圓，樹突融解、消失，細(xì)胞連接明顯減少，細(xì)胞增殖率明顯降低。

Fig 1 Cell morphology of the different treated groups(100×)

2.2 電泳檢測RNA純度 由RNA電泳圖可以看RNA在28S和18S有兩條清晰的表達(dá)條帶，沒有拖尾，說明無DNA殘留;并且28S與18S的表達(dá)均約為2∶1。因此可知細(xì)胞中提取的RNA完整性好，品質(zhì)合格，可以進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.3 SH-SY5Y細(xì)胞受藜蘆定堿毒性作用前后的顯著差異表達(dá)基因 SH-SY5Y細(xì)胞受藜蘆定堿作用后L、M、H組與N組相比較，顯著差異表達(dá)基因分別有71、182、77 條，其中上調(diào)基因分別有 45、81、45條，下調(diào)基因分別為26、101、32條。在差異表達(dá)基因中包括GSH相關(guān)基因，RNA功能、DNA修復(fù)及蛋白合成相關(guān)基因，細(xì)胞物質(zhì)與能量代謝 、線粒體功能相關(guān)基因，細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，蛋白氧化磷酸化作用、細(xì)胞信號傳導(dǎo)相關(guān)基因，以及一些代謝相關(guān)酶類相關(guān)基因。

2.4 差異表達(dá)基因聚類分析 用Cluster 3.0軟件對4組差異表達(dá)基因進(jìn)行處理，選擇傳統(tǒng)聚分析方法，聚類結(jié)果如Fig 3所示。由聚類分析可知，N組與L組可以聚為一類，M組與H組可以聚為一類。在前一類中差異表達(dá)基因較少，而后一類差異表達(dá)基因較多。表明差異表達(dá)基因可以很好的區(qū)分藜蘆定堿不同濃度處理組。

Tab 1 Part of the significant upregulated genes in SH-SY5Y treated by veratridine 50 mmol·L －1

Tab 3 Part of the significant upregulated genes in SH-SY5Y treated by veratridine 200 μmol·L －1

Tab 4 Part of the significant downregulated genes in SH-SY5Y treated by veratridine 200 μmol·L －1

Tab 5 Part of the significant upregulated genes in SH-SY5Y treated by veratridine 800 μmol·L －1

3 討論

基因芯片技術(shù)是一種新的基因表達(dá)研究方法，它利用核酸雜交的原理，在固體支持物上一次檢測成百上千乃至上萬種基因的表達(dá)水平，具有傳統(tǒng)方法無可比擬的高通量特點，達(dá)到了一定意義上的全基因表達(dá)譜的檢測。本文采用基因芯片技術(shù)篩選藜蘆定堿對神經(jīng)細(xì)胞毒性作用的差異表達(dá)基因，試圖初步揭示其毒性發(fā)生機制。

Tab 6 Part of the significant downregulated genes in SH-SY5Y treated by veratridine 800 μmol·L －1

本研究通過利用表達(dá)譜基因芯片篩選藜蘆定堿對SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞受藜蘆定堿毒性作用過程中，相關(guān)基因表達(dá)水平有顯著變化。本實驗對表達(dá)差異基因運用系統(tǒng)聚類分析，按照藜蘆定堿不同處理濃度與基因表達(dá)的關(guān)系，將藥物處理濃度各視為一類，在此基礎(chǔ)上考察藜蘆定堿對神經(jīng)細(xì)胞毒性作用的基因表達(dá)結(jié)果，并將結(jié)果進(jìn)行合并分析。

Fig 3 Cluster analysis result of differentially expressed genes

在神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y的基因表達(dá)譜中，藜蘆定堿低濃度組與對照組比較顯著性差異表達(dá)基因共有71條，其中上調(diào)基因45條，下調(diào)基因26條;中濃度組與對照組比較顯著性差異表達(dá)基因共有182條，其中上調(diào)基因81條，下調(diào)基因101條;高濃度作用組與對照組比較顯著性差異表達(dá)基因共有77條，其中上調(diào)基因45條，下調(diào)基因32條。在差異表達(dá)基因中，涉及GSH相關(guān)基因(DCAF12)，RNA修復(fù)及蛋白合成相關(guān)基因(RPS11，RPS27A，RPSAP58)，RNA功能相關(guān)基因(RN7SK，RN28S1)，細(xì)胞物質(zhì)與能量代謝相關(guān)基因(ATP1A1)，線粒體功能相關(guān)基因(MRPL16)，蛋白氧化磷酸化相關(guān)基因(PPP1R)，細(xì)胞信號傳導(dǎo)相關(guān)基因(MAPKAP1，MAP4K4，RNF)，細(xì)胞周期相關(guān)基因(CCNL1)，細(xì)胞分化相關(guān)基因(ZNF)，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(USP38，ANXA3)，以及一些代謝相關(guān)酶類相關(guān)基因(GLT，GCAT)。

GSH在生命活動中起著直接或間接的作用，參與對細(xì)胞的保護(hù)、基因表達(dá)調(diào)控、酶活性和物質(zhì)代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運、免疫功能調(diào)節(jié)等，且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可以充當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)的作用;GSH是機體主要的抗氧化劑之一［10］，其含量的降低是一種潛在的凋亡早期激活信號，因為隨后產(chǎn)生的氧自由基可促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。

細(xì)胞凋亡過程中線粒體也發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用，在外部刺激作用下，線粒體能夠釋放促凋亡因子如細(xì)胞色素C，激活凋亡蛋白酶Caspase;活化后的Caspase可以反作用于線粒體，引發(fā)更大量的細(xì)胞色素C的釋放，形成細(xì)胞色素C釋放的正向反饋調(diào)節(jié)機制，從而激發(fā)下游的凋亡執(zhí)行者，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

從研究結(jié)果中，我們看到與細(xì)胞信號傳導(dǎo)有關(guān)的基因如蛋白激酶和MAPK相關(guān)基因也有差異性表達(dá)，MAPK蛋白激酶途徑是一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，該信號通路廣泛參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程，且MAPK蛋白激酶在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。

上述基因的變化可能與藜蘆定堿對SH-SY5Y細(xì)胞毒性作用有關(guān)，同時推測，這些基因參與了毒性作用過程。在聚類分析結(jié)果圖中我們看到，藜蘆定堿200 μmol·L－1處理后，基因表達(dá)普遍上升，而800 μmol·L－1處理時，基因表達(dá)又有所降低，此現(xiàn)象，從生物學(xué)意義上來說是可能的。由于聚類分析圖所表示出來的只是一部分差異較顯著的基因，在聚類分析結(jié)果里，變化的模式有很多種，從研究結(jié)果中我們能達(dá)到利用基因芯片技術(shù)篩選藜蘆定堿對SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性的相關(guān)基因的目的，而后續(xù)研究將挑選具體變化模式做進(jìn)一步的驗證工作。綜上，該實驗結(jié)果為研究藜蘆定堿對SH-SY5Y毒性作用的機制提供了實驗依據(jù)，為臨床安全合理應(yīng)用藜蘆和藜蘆神經(jīng)中毒救治提供參考。

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