短鏈脂酰輔酶A脫氫酶與心肌肥大關(guān)系的初步探索

羅佳妮，周四桂，陳少銳，陳 溪，鄒 劍，耿 彪，劉培慶

(1.中山大學(xué)藥學(xué)院藥理與毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006，2.廣東藥學(xué)院臨床藥學(xué)系，廣東廣州 510006)

心肌肥大是高血壓最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，是心臟對(duì)血流動(dòng)力學(xué)壓力超負(fù)荷、神經(jīng)體液激素改變以及能量代謝障礙等而發(fā)生的一系列病理性適應(yīng)過(guò)程。其主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞的肥大和間質(zhì)成分的改變，心臟順應(yīng)性和循環(huán)泵功能的降低，心臟功能由代償發(fā)展為失代償，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的心律失常和心衰［1］。心肌是耗能最多的組織之一。胚胎時(shí)期哺乳動(dòng)物的心肌處于相對(duì)缺氧的環(huán)境中，以葡萄糖和丙酮酸為主要能源物質(zhì)，但在出生后迅速轉(zhuǎn)化為依賴(lài)脂肪酸氧化供能，正常心肌能量的70%都來(lái)源于脂肪酸氧化［2］。因此，線粒體脂肪酸β氧化對(duì)于維持心肌能量代謝有重要意義。但是，在病理性心肌肥厚過(guò)程中，心肌能量來(lái)源又轉(zhuǎn)向葡萄糖和丙酮酸，即“胚胎型轉(zhuǎn)換”，最終導(dǎo)致心臟能源供應(yīng)不足［3］。因此，促進(jìn)脂肪酸β氧化對(duì)于預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌肥大、心力衰竭等病理生理惡性循環(huán)有重要意義。

脂酰輔酶A脫氫酶家族中的短鏈脂酰輔酶A脫氫酶(short-chain acly-coenzyme A dehydrogenase，SCAD)是脂肪酸氧化第一步β氧化的第1個(gè)限速步驟酶。SCAD的分子質(zhì)量為160 000，由4個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基的分子質(zhì)量為41 000左右。SCAD基因定位于12q22，長(zhǎng)度為13 ku，由10個(gè)外顯子和1 236個(gè)核苷酸組成［4－5］。脂酰輔酶 A脫氫酶家族中，中鏈脂酰輔酶A脫氫酶是肌型肉堿棕櫚酰易位酶的關(guān)鍵酶;長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A脫氫酶的底物長(zhǎng)鏈脂肪酸，是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(Peroxisome proliferator-activated receptorα，PPARα)的內(nèi)源性激活配體。脂酰輔酶A脫氫酶家族發(fā)揮作用需要黃素腺嘌呤二核苷酸，而SCAD是脂酰輔酶A脫氫酶家族成員中和黃素腺嘌呤二核苷酸綁定最緊密的一員，且SCAD特異性地分解短鏈脂酰輔酶A底物［6］，說(shuō)明了該家族在心肌肥大和能量代謝中的重要作用。

然而，對(duì)于短鏈脂酰輔酶A脫氫酶(SCAD)的研究以往主要集中在其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)作用的方面［5］，而在心臟中的作用研究較少。本實(shí)驗(yàn)室采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)(DIGE)技術(shù)比較了16周齡自發(fā)性高血壓大鼠和血壓正常大鼠的心肌蛋白質(zhì)組，首次發(fā)現(xiàn)SCAD在自發(fā)性高血壓大鼠肥大心肌中的表達(dá)明顯降低［7］。本研究進(jìn)一步采用自發(fā)性高血壓大鼠和異丙腎上腺素皮下注射大鼠心肌肥大的模型進(jìn)行驗(yàn)證，并從細(xì)胞水平針對(duì)SCAD在心肌肥大中的改變進(jìn)行初步研究，旨在于探索兩者之間的關(guān)系，為尋找心肌肥大新的藥物靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 自發(fā)性高血壓大鼠 自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，13周齡，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組正常采用Wistar大鼠，購(gòu)于中山大學(xué)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg·kg－1)麻醉后，頸總動(dòng)脈插管采用 BL-420S生物信號(hào)記錄儀測(cè)量血壓，腹腔靜脈注射KCl(2 mol·L－1)使大鼠心臟驟停在舒張期，迅速打開(kāi)胸腔取出心臟，用預(yù)冷的PBS溶液清洗，吸干水分后用電子天平稱(chēng)量心臟重量(heart weight，HW)以及左心室重量(left ventricular weight)，計(jì)算左心室重指數(shù)(LVW/BW)。組織樣本經(jīng)過(guò)液氮速凍過(guò)夜后凍存于－80℃冰箱，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng) 采用本實(shí)驗(yàn)室已建立的乳鼠心肌細(xì)胞改良法分離并培養(yǎng)心細(xì)胞［8］，取2～3 d SD乳鼠(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)用胰蛋白酶(Sigma)冰上消化20 min后，37℃水浴多次消化將乳鼠心臟消化成為單細(xì)胞懸液，在差速貼壁分離后，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并加入0.1 mmol·L－1Brdu(Sigma)抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。按照上述方法分離制備的心肌細(xì)胞，經(jīng)alpha-actin抗體的免疫細(xì)胞化學(xué)染色，純度可達(dá)95%以上，符合實(shí)驗(yàn)要求。

1.3 心肌細(xì)胞肥大模型的建立 采用苯腎上腺素(phenylephrine，PE，Sigma)建立心肌細(xì)胞的肥大模型［9］，濃度為 0.1 μmol·L－1。在無(wú)血清培養(yǎng)基(Gibco)培養(yǎng)24 h 后，按照 3、6、12、24、48 h 的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行加藥刺激。

1.4 RT-PCR檢測(cè)SCAD的mRNA表達(dá) 按照TRIzol(Invitrogen)說(shuō)明書(shū)步驟提取細(xì)胞或組織總RNA，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品的260 nm、280 nm波長(zhǎng)下的 OD值，檢測(cè)純度并計(jì)算出RNA的濃度。參照Takara有限公司RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將反應(yīng)罐放置于PCR儀(Thermo)中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.4.1 Real-Time PCR 擴(kuò)增 兩步法進(jìn)行 PCR擴(kuò)增反應(yīng)，按照說(shuō)明書(shū)加入熒光染料(TaRaKa)、序列和RT產(chǎn)物后在Real-time PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù):30℃ 10 min，42℃ 60 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min(1個(gè)循環(huán))。

1.4.2 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的引物序列 具體引物序列見(jiàn)Tab 1(上海英濰捷基)。

1.5 Western blot檢測(cè)SCAD的蛋白表達(dá) 提取各組心肌細(xì)胞以及組織總蛋白，BCA試劑盒(Pierce)檢測(cè)細(xì)胞蛋白含量后調(diào)整上樣量，分裝、變性，配置10%SDS分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore)，室溫封閉1 h后加入一抗(SCAD，1∶1 000，Abcam;α-Tubulin，1∶10 000，Sigma)，過(guò)夜。漂洗后加入二抗，室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光試劑增強(qiáng)反應(yīng)，X線壓片曝光、顯影、定影，結(jié)果采用Image J圖像分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行分析。

1.6 siRNA干擾 siRNA干擾序列購(gòu)于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，按照其說(shuō)明書(shū)使用 Lipofectamine 2000(Invitrogen)和Opti-MEMI(Invitrogen)培養(yǎng)基在心肌細(xì)胞上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。提取蛋白和總RNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。具體siRNA序列為:sense:5'CCGCAUCACUGAGAUCUAUTT3'，antisense:5'AUAGAUCUCAGUGAUGCGGTT3'。

Tab 1 Primer sequence of RT-PCR amplification product

2 結(jié)果

2.1 自發(fā)性高血壓大鼠和異丙腎上腺素皮下注射大鼠體重及左心室重量、左心室重量指數(shù)的變化從Tab 2中可以看出，與Wistar大鼠相比，SHR的左心室重量和左心室重量指數(shù)都明顯增高;與生理鹽水對(duì)照組大鼠比較，異丙腎上腺素皮下注射大鼠模型組的左心室重量和左心室重量指數(shù)也明顯增高，說(shuō)明兩種大鼠模型都發(fā)生了明顯的心肌肥大。

Tab 2 Left ventricular mass index in spontaneously hypertensive rats and isoproterenol stimulated model(n=8)

Fig 1 Expression of protein and mRNA in spontaneously hypertensive rats’left ventricular

2.2 自發(fā)性高血壓大鼠左心室SCAD蛋白以及mRNA表達(dá)的變化 Western blot結(jié)果顯示，SHR左心室中目的蛋白SCAD的表達(dá)量明顯下降，與實(shí)驗(yàn)室前期蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中觀察到的現(xiàn)象相符合。在mRNA水平，與正常對(duì)照的Wistar大鼠相比較，SHR組中心房利鈉因子(atrial natriuretic factor，ANF)和腦利鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)的表達(dá)量均明顯上升，有明顯的肥大表現(xiàn)，而SCAD則出現(xiàn)明顯下降，見(jiàn)Fig 1。同時(shí)，我們采用了本實(shí)驗(yàn)室中異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)皮下注射制造心肌肥大模型的左心室組織標(biāo)本，對(duì)目的蛋白進(jìn)行了檢測(cè)，從Western blot的結(jié)果中可以看出，與正常對(duì)照組相比較，模型組中SCAD的表達(dá)也明顯下降，與自發(fā)性高血壓大鼠的變化趨勢(shì)一致，見(jiàn)Fig 1。

2.3 心肌細(xì)胞肥大模型中SCAD的蛋白以及mRNA表達(dá)的變化 RT-PCR結(jié)果顯示，PE刺激12 h后肥大標(biāo)志基因ANF和BNP整體呈上升趨勢(shì)，尤其刺激24 h時(shí)ANF和BNP均上升明顯，見(jiàn)Fig 2。PE刺激48 h內(nèi)，SCAD整體表達(dá)均有下降，其中以24 h下降最為明顯。Western blot的結(jié)果顯示出與RT-PCR結(jié)果相一致的趨勢(shì)，SCAD的整體表達(dá)均有下降，并且在24h時(shí)蛋白表達(dá)量下降最為明顯，見(jiàn)Fig 3。

Fig 2 mRNA expression of SCAD in pe-stimulated cardiomyocyte

3.4 siRNA干擾引起心肌細(xì)胞的變化 蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)水平結(jié)果均顯示siRNA干擾可以明顯降低心肌細(xì)胞中SCAD的表達(dá)量，并且在降低了SCAD的表達(dá)后，心肌細(xì)胞的肥大標(biāo)記因子ANF、BNP的表達(dá)量均有明顯上升，呈現(xiàn)出負(fù)性調(diào)節(jié)的趨勢(shì)，說(shuō)明目的基因SCAD的下降可能參與了心肌肥大的病理過(guò)程，見(jiàn)Fig 4。

Fig 3 Protein expression of SCAD in pe-stimulated cardiomyocyte*P＜0.05 vs control

4 討論

高血壓引起的心肌肥大是心臟對(duì)急、慢性血流動(dòng)力學(xué)超負(fù)荷的一種適應(yīng)性反應(yīng)，是心臟為適應(yīng)長(zhǎng)期的壓力或容量負(fù)荷而產(chǎn)生的代償性改變。這種病理生理改變以心肌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成增加和細(xì)胞體積增大為主要特征。心肌肥厚歷經(jīng)代償性肥大到失代償性肥大再過(guò)渡到心衰的過(guò)程，與其中能量代謝由胚胎期低氧耗代謝到出生后脂肪酸的高氧耗代謝，再到病理狀況下低氧耗并最終導(dǎo)致能量饑餓引起心律失常和心衰的過(guò)程一致［2－3］。

能量代謝的改變是心肌肥大過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。肥大心肌中脂肪酸利用的減少促進(jìn)了心肌對(duì)葡萄糖氧化的增加，導(dǎo)致肥大心肌能量代謝的“胚胎型再演”，這一轉(zhuǎn)換使得心肌處于能量饑餓狀態(tài)，同時(shí)脂肪酸利用減少導(dǎo)致心肌組織總脂質(zhì)沉積增加，也對(duì)其穩(wěn)定性有一定的影響。研究發(fā)現(xiàn)，先天性脂酰輔酶A脫氫酶當(dāng)中短鏈、中鏈和極長(zhǎng)鏈基因突變的新生兒，在應(yīng)急誘導(dǎo)下會(huì)發(fā)生低血糖、肝功能不全、心肌病以及猝死等狀況。研究還表明在自發(fā)性高血壓心力衰竭小鼠模型中，心肌脂肪酸氧化酶的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄大量減少，PPARα減少到胚胎水平，充分說(shuō)明了脂肪酸氧化在心肌肥大過(guò)程中的重要作用［10］。

Fig 4 Results of downregulating SCAD with siRNA in myocardial cells

本研究著重探索SCAD和心肌肥大之間的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在不同的動(dòng)物模型和細(xì)胞肥大模型中，SCAD的蛋白表達(dá)均明顯下降，呈現(xiàn)出較好的一致性。在mRNA水平，雖然在PE刺激心肌細(xì)胞肥大的時(shí)效模型當(dāng)中，SCAD的整體下降水平不是十分明顯，推測(cè)可能是由于翻譯后調(diào)節(jié)造成，也可能是由于蛋白水平下降明顯，mRNA水平反饋性增加表達(dá)量以期蛋白水平的表達(dá)能夠均衡。有研究報(bào)道［11］，肥大心肌脂肪酸利用相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控路徑與正常心肌不同。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在SHR和異丙腎上腺素皮下注射兩種整體動(dòng)物水平，SCAD的mRNA均明顯下降，與SCAD的蛋白表達(dá)水平下降一致［13］。SCAD蛋白是其發(fā)揮酶活性的功能成分，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明SCAD在心肌肥大中可能具有重要作用。

此外，我們采用RNA干擾技術(shù)，觀察到siRNA干擾心肌細(xì)胞引起SCAD表達(dá)下調(diào)的同時(shí)，心肌肥大標(biāo)記因子ANF和BNP均明顯上升，說(shuō)明SCAD表達(dá)量的減少對(duì)于心肌肥大過(guò)程有重要的影響。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)SCAD表達(dá)量的減少會(huì)導(dǎo)致其底物丁酰輔酶A的堆積，最終表現(xiàn)為血漿中丁酰肉堿濃度增加以及尿液中乙基丙二酸的含量增加，心肌能量代謝受到影響，出現(xiàn)心肌肥大及心臟功能障礙，為SCAD表達(dá)下降和心肌肥大之間的關(guān)系提供了進(jìn)一步的證據(jù)［4－5］。

作為脂酰輔酶A脫氫酶家族中的一員，有文獻(xiàn)報(bào)道PPARα敲除小鼠心肌中中鏈和長(zhǎng)鏈脂肪酸的β-氧化均有降低［12］。脂酰輔酶A脫氫酶家族成員的基因編碼同源性大，但底物的特異性也大［6］，雖然PPARα敲除小鼠心肌中短鏈脂肪酸的β-氧化能力是否有降低尚未見(jiàn)報(bào)道，但是文獻(xiàn)證明短鏈脂酰只需肉毒堿轉(zhuǎn)移酶存在即可進(jìn)入線粒體進(jìn)行氧化產(chǎn)能，在心肌肥大的情況下短鏈脂肪酸表達(dá)量卻也有降低。PPAR家族在心臟代謝中起著轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用，維持脂質(zhì)和能量代謝。因此，PPARα對(duì)于SCAD可能也具有直接的調(diào)控作用，激活PPARα是否能夠增加SCAD的表達(dá)，是否能夠逆轉(zhuǎn)心肌肥大的發(fā)生值得進(jìn)一步研究，SCAD能否成為新的抗心肌肥大藥物靶點(diǎn)，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

［1］Vogt M，Motz WH，Schwartzkopf B，et al.Pathophysiology and clinical aspects of hypertensive hypertrophy［J］.Eur Heart J，1993，14:2－7.

［2］Joanne S.Energy metabolism in heart failure and remodeling［J］.Cardiovascular Res，2009，81:412－9.

［3］Stuck BJ，Lenski M，B?hm M，et al.Metabolic switch and hypertrophy of cardiomyocytes following treatment with angiotensinⅡare prevented by AMP-activated protein kinase［J］.J Biol Chem，2008，283(47):32562－9.

［4］Reena Jethva ，Michael J.Bennett，Jerry Vockley.Short-chain acyl-coenzyme A dehydrogenase de?ciency［J］.Molecular Genetics and Metabolism，2008，95:195－200.

［5］Biancat T，Van Maldegem，Marinus Duran，Ronald J A.Wanders，ed.Flavin adenine dinucleotide status and the effects of highdose ribofavin treatment in short-chain acyl-coA dehydrogenase defciency［J］.Pediatric Res，2010，67:3.

［6］Yasuyuki Ikeda，Kazuko Okamura-Ikeda，Kay Tanaka.Purification and Characterization of Short-chain，Medium-chain，and Longchain Acyl-CoA Dehydrogenases from rat liver mitochondria［J］.J Biol Chem，1985，260(2):1311－25.

［7］Zhou S G，Zhou S F，Huang H Q，et al.Proteomic analysis of hypertrophied myocardial protein patterns in renovascularly hypertensive and spontaneously hypertensive rats［J］.J Prot Res，2006，5:2901－8.

［8］Fu J J，Gao J，Pi R B，et al.An optimized protocol for culture of cardiomyocyte from neonatal rat［J］.Cytotechnology，2005，49:109－16.

［9］陳 龍，王玲玲，徐 斌，等.苯腎上腺素延長(zhǎng)糖尿病大鼠心臟QT間期的機(jī)理研究［J］.中藥藥理與臨床，2007，23:6.

［9］Chen L，Wang L L，Xu B，ed al.Studies on ionic mechanisms underlying prolongation of QT i nterval by pheny lephr ine in diabetic rats［J］.Pharmacol Clin，2007，23:6.

［10］Philip M.Barger，Jon M.Brandt，TeresaC.Leone，et al.Deactivation of peroxisome proliferator activated receptor-α during cardiac hypertrophic growth［J］.J Clin Invest，2000，105(12):1723－30.

［11］Gu L，Zhu N，Zhang H，et al.Regulation of XIAP translation and induction by MDM2 following irradiation［J］.Cancer Cell，2009，15(5):363－75.

［12］Brian N.Finck.The PPAR regulatory system in cardiac physiology and disease［J］.Card Res，2007，73:269－77.

［13］周四桂，潘雪刁，唐富天，等.依那普利對(duì)腎性與自發(fā)性高血壓大鼠右心室Eno1及asTM2表達(dá)的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(6):736－40.

［13］Zhou S G，Pan X D，Tang F T，et al.Effert of enalapooy on the expression of Eno1 and asTM2 in renovasculomly hypertensive and eporneonsly hypertersince rats［J］.Chines Pharmaolo Bull，2008，24(8):730－40.