兩種苦瓜藤多糖提取工藝的比較分析

曾哲靈，奚光興，葛曉環(huán)

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047；2.南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西南昌330031；3.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西南昌330031）

苦瓜又名涼瓜，是葫蘆科植物，為一年生攀緣草本。苦瓜的多個(gè)部位都能入藥，苦瓜藤能清熱解毒，治痢疾、瘡毒、胎毒、牙痛。《四川中藥志》就有記載：“性涼，味苦，無(wú)毒。”入脾、胃二經(jīng)?？喙虾卸喾N有效成分，其中苦瓜多糖藥用價(jià)值很高，具有提高免疫力、降血糖、抑菌、抗氧化、抗腫瘤、抑制艾滋病毒HIV的表面活性等作用[1-7]。常見的多糖提取方法有熱水浸提法、酸浸提法、堿浸提法、酶法等[8-13]。熱水浸提法是一種比較普遍的天然有機(jī)物的提取方法，但是耗能費(fèi)時(shí)，且對(duì)熱敏性的天然物質(zhì)具有一定的破壞作用，是一種局限性非常大的提取方法；而酸堿提法對(duì)有機(jī)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞性比較強(qiáng)，也不利于天然物質(zhì)的開發(fā)利用；酶法提取則成本較高，難以回收利用。因此，有必要開發(fā)一種高效、節(jié)能、綠色的多糖提取方法。天然植物的有效成分大多為細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，提取時(shí)需將植物細(xì)胞破碎，現(xiàn)有的機(jī)械破碎法難以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的有效破碎，化學(xué)方法容易造成被提取物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)變化，因而很難達(dá)到理想效果。超聲波提取技術(shù)逐漸興起，其操作簡(jiǎn)單快速、多糖提取率高、速度快、效果好，且多糖結(jié)構(gòu)被破壞作用小的優(yōu)勢(shì)日益突出。超聲波提取應(yīng)用于多種多糖的提取也早有報(bào)道，但其應(yīng)用于苦瓜藤多糖的提取卻未見報(bào)道。本文優(yōu)化了超聲波提取苦瓜藤多糖的工藝條件，并與傳統(tǒng)方法作比較，以期得出一個(gè)最優(yōu)的苦瓜藤多糖提取工藝參數(shù)，為進(jìn)一步研究苦瓜藤多糖的藥效和結(jié)構(gòu)組成提供一定的理論支持，促進(jìn)苦瓜藤的開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦瓜藤 購(gòu)自農(nóng)村；牛血清蛋白 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；葡萄糖、考馬斯亮藍(lán)G-250、磷酸、苯酚、濃硫酸、鹽酸溶液、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇等試劑 皆為國(guó)產(chǎn)分析純。

KQ5200E型超聲波清洗器（40KHZ，200W） 昆山超聲儀器有限公司；HH恒溫水浴箱 中大儀器廠；765pc型紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苦瓜藤多糖的提取工藝流程 新鮮的苦瓜藤曬干后，剪成2～3cm的小段，粉碎機(jī)粉碎，60℃條件下烘干至無(wú)游離水，取一定量的苦瓜藤藤粉末，按一定條件超聲波提取后，離心取上清液，過濾，50℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮提取液，加入4倍體積的無(wú)水乙醇，4℃下醇沉8～12h，醇沉兩次，離心，乙醚洗滌，烘干，得苦瓜藤粗多糖。

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[14-15]準(zhǔn)確稱取105℃烘至恒重的葡萄糖標(biāo)品1g，蒸餾水定容至1L，移取2mL，用25mL的容量瓶定容，得0.08mg/mL葡萄糖標(biāo)液。分別吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL葡萄糖標(biāo)液于25mL比色管中，補(bǔ)足蒸餾水至2.0mL，加1.0mL 6%苯酚，再加入5.0mL濃硫酸，搖勻，靜置冷卻至室溫，在490nm處測(cè)定吸光度值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖含量與吸光度值經(jīng)回歸處理，回歸方程為：A=14.373C-0.0133，R2=0.9969（n=8），糖含量在8～64μg線性良好，見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

1.2.3 苦瓜藤多糖得率的測(cè)定[16]取提取液上清液，過濾，定容至250mL，分別吸取0.1mL提取液，補(bǔ)足水至2.0mL，測(cè)定吸光度值，根據(jù)測(cè)得的吸光度值A(chǔ)，參照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出多糖濃度，進(jìn)而得到得率。

1.2.4 超聲波提取單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 提取溫度 準(zhǔn)確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份，料液比為1∶40（g/mL），pH為7，分別取30、40、50、60、70℃，超聲提取20min，離心取上清液，過濾，計(jì)算多糖得率，每個(gè)因素做四個(gè)平行。

1.2.4.2 料液比 準(zhǔn)確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份，溫度為60℃，pH為7，料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL），超聲20min，余下操作如1.2.4.1。

1.2.4.3 提取時(shí)間 準(zhǔn)確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份，溫度為60℃、料液比1∶30（g/mL），pH為7，分別超聲10、20、30、40、50min，之后操作如1.2.4.1。

1.2.4.4 pH 準(zhǔn)確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份，溫度60℃、料液比1∶30（g/mL）、超聲時(shí)間30min，研究不同pH條件3、5、7、9、11下的多糖提取得率，余下操作如1.2.4.1。

1.2.5 苦瓜藤多糖超聲波提取的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[17]在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，因素水平表見表1。

表1 超聲波提取苦瓜藤多糖正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design of ultrasound-assisted extraction

1.2.6 熱水提取法單因素實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)熱水提取法單因素實(shí)驗(yàn)，并優(yōu)化工藝，比較分析兩種提取方法的優(yōu)劣。以料液比、提取時(shí)間、提取溫度這3個(gè)單因素為研究目標(biāo)。

1.2.6.1 料液比 準(zhǔn)確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份，溫度70℃，料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL），熱水提取90min，之后操作如1.2.4.1。

1.2.6.2 時(shí)間 準(zhǔn)確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份，溫度70℃、料液比1∶50（g/mL），分別浸提30、60、90、120、150min，之后操作如1.2.4.1。

1.2.6.3 溫度 準(zhǔn)確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份，料液比1∶50（g/mL）、浸提時(shí)間90min，分別在50、60、70、80、90℃條件下提取，之后操作如1.2.4.1。

1.2.7 苦瓜藤多糖熱水提取的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9（33）正交實(shí)驗(yàn)，因素水平表見表2。

表2 熱水提取苦瓜藤多糖正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels in orthogonal array design of hot-water extraction

1.2.8 超聲波提取法與熱水提取法的比較 分別取5.0g苦瓜藤粉末2份，分別用超聲波與熱水提取的最佳工藝各提取2次，測(cè)定其多糖濃度，得出多糖得率，比較兩種方法的提取效率。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平行4次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。數(shù)據(jù)采用Graph Pad Prism（5.01版）進(jìn)行分析，結(jié)果顯示單因素?cái)?shù)據(jù)的p值＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)顯著性。采用正交助手Ⅱ（3.1版）對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀、極差和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1.1 提取溫度對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響 由圖2可見，苦瓜藤多糖得率隨著溫度的升高而上升，但到達(dá)60℃時(shí)趨于平緩，考慮到在高溫下部分多糖分子會(huì)發(fā)生鍵的斷裂，結(jié)構(gòu)破壞，其活性會(huì)遭到破壞。同時(shí)過高的溫度對(duì)設(shè)備要求較高，耗能大，故溫度選在60℃為宜。

圖2 溫度對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasound extracting temperature on the polysaccharide yield

2.1.1.2 料液比對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響 由圖3可知，苦瓜藤多糖的得率隨著料液比先增高后下降，在1∶30（g/mL）達(dá)到最大。1∶30（g/mL）以后提取率下降的原因，可能是料液比過大，會(huì)增加超聲波破碎細(xì)胞的阻力，使細(xì)胞破碎程度下降，降低多糖的提取率；如果料液比過小，又沒有足夠的水溶解出苦瓜藤多糖，也會(huì)使提取率降低[18]。故料液比宜取1∶30（g/mL）。

圖3 料液比對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasound ratio of solid to liquid on the polysaccharide yield

2.1.1.3 超聲時(shí)間對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響 由圖4可知，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，提取率逐漸上升，到30min時(shí)達(dá)到最大，時(shí)間再增加時(shí)提取率又會(huì)下降，造成這一現(xiàn)象的原因可能是超聲波作用的時(shí)間過長(zhǎng)，也會(huì)使得部分多糖的高分支結(jié)構(gòu)受到破壞，使其溶于水的特性消失[18]，從而降低了多糖提取率。故時(shí)間宜取30min。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasound extraction time on the polysaccharide yield

2.1.1.4 pH環(huán)境對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響 由圖5可見，多糖得率隨著pH增加而升高，可見多糖在酸性環(huán)境下不穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)易變化，或分解，造成提取率降低，而在堿性環(huán)境下比較穩(wěn)定，但是，過堿的環(huán)境對(duì)多糖的品質(zhì)會(huì)有一定的影響，且多糖得率從pH為7時(shí)增幅就不大，故pH宜取7。

圖5 pH對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響Fig.5 Effect of ultrasound extraction pH on the polysaccharide yield

2.1.2 超聲波提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 超聲波提取苦瓜藤多糖正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，四因素對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響大小為：A＞C＞D＞B，即溫度＞超聲時(shí)間＞pH＞料液比。其最佳提取工藝參數(shù)為A3B3C3D3，但由于pH和料液比為次要因素，為節(jié)約成本考慮，調(diào)整pH為7，料液比為1∶30（g/mL），其組合為A3B2C3D2。與A3B3C3D3做驗(yàn)證性比較，結(jié)果表明，A3B2C3D2的得率為2.36%，A3B3C3D3得率為2.38%，而表中A3B1C3D2的得率為2.35%。由此可見，從提取率和能源節(jié)約兩方面綜合考慮，A3B1C3D2可為最優(yōu)提取工藝。根據(jù)最優(yōu)提取工藝分別提取1、2、3次，結(jié)果表明，一次提取率為2.35%，兩次提取混合液為提取率為3.08%，三次提取混合液為3.44%，三次提取增幅很小，出于經(jīng)濟(jì)因素考慮，取2次提取為宜，因此，超聲提取苦瓜藤多糖的最優(yōu)工藝為：提取溫度65℃、料液比1∶25（g/mL）、超聲時(shí)間35min、pH為7，浸提2次。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal array design results of ultrasound-assisted extraction

2.2 熱水提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 料液比對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響 由圖6可知，苦瓜藤多糖的得率隨著料液比先增高后下降，在1∶50（g/mL）達(dá)到最大。1∶50（g/mL）以后提取率略有下降，如果料液比過小，又沒有足夠的水溶解出苦瓜藤多糖，也會(huì)使提取率降低。故料液比宜取1∶50（g/mL）。

圖6 料液比對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響Fig.6 Effect of ratio of solid to liquid on the polysaccharide yield

2.2.1.2 浸提時(shí)間對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響 由圖7可知，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，提取率逐漸上升，到90min時(shí)達(dá)到最大，時(shí)間再增加時(shí)提取率又會(huì)下降，造成這一現(xiàn)象的原因可能是熱提時(shí)間會(huì)使得部分多糖的高分支結(jié)構(gòu)受到破壞，使其溶于水的特性消失，從而降低了多糖提取率[18]。故時(shí)間宜取90min。

圖7 熱提時(shí)間對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響Fig.7 Effect of extraction time on the polysaccharide yield

2.2.1.3 提取溫度對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響 由圖8可見，苦瓜藤多糖得率隨著溫度的升高而先升后降，在70℃時(shí)提取率最高，在高溫下部分多糖分子會(huì)發(fā)生鍵的斷裂，結(jié)構(gòu)破壞，其活性會(huì)遭到破壞[19]，故溫度選在70℃為宜。

圖8 浸提溫度對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響Fig.8 Effect of extracting temperature on the polysaccharide yield

2.2.2 熱提法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 熱水提取苦瓜藤多糖正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal array design results of ultrasound-assisted extraction

由表4可知，三因素對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響大小為B＞A＞C，即料液比＞浸提溫度＞浸提時(shí)間，其最佳提取工藝參數(shù)為A3B3C2。結(jié)果表明，A3B3C2的得率為2.30%，在九組實(shí)驗(yàn)中最大，表明A3B3C2可為最優(yōu)提取工藝。根據(jù)最優(yōu)提取工藝分別提取1、2、3次，結(jié)果顯示，第一次提取率可達(dá)2.30%，二次提取混合液3.06%，三次提取混合液為3.43%，兩次提取比較完全，三次提取增幅不大，因此，熱水提取苦瓜藤多糖的最優(yōu)工藝為：提取溫度75℃、料液比1∶55（g/mL）、提取時(shí)間90min，浸提2次。

2.3 超聲波提取法與熱水提取法的比較

在各自的最佳工藝條件下，超聲波提取35min提取率能達(dá)到2.35%，熱水提取90min提取率為2.30%。由此與熱水提法相比，超聲波提取法節(jié)約了將近60%的時(shí)間，效率約為水提法的2.5倍；兩種方法的兩次提取總量相當(dāng)，說明第二次提取時(shí)細(xì)胞粉碎程度比較完全，超聲波的影響已經(jīng)不太顯著，但總的來(lái)說，提取液的用量和提取溫度也比熱水提取法少的多，符合綠色節(jié)能的發(fā)展要求。

3 結(jié)論

通過本實(shí)驗(yàn)的研究，得出苦瓜藤多糖超聲提取的最優(yōu)工藝為：提取溫度65℃、料液比1∶25（g/mL）、超聲時(shí)間35min、pH為7，浸提2次，四因素對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響大小為：溫度＞超聲時(shí)間＞pH＞料液比。熱水提取苦瓜藤多糖的最優(yōu)工藝為：提取溫度75℃、料液比1∶55（g/mL）、提取時(shí)間90min，浸提2次，三因素對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響大小為：料液比＞浸提溫度＞浸提時(shí)間。

通過兩種提取法的最佳工藝的比較發(fā)現(xiàn)，超聲波提取法的效率約是傳統(tǒng)熱水提取法的2.5倍，驗(yàn)證了超聲波提取的高效性。由單因素的結(jié)果可以看出，苦瓜藤多糖對(duì)熱、酸不是很穩(wěn)定，所以提取苦瓜藤多糖時(shí)要避免高溫、加熱過久，pH環(huán)境不可過酸，以便得到較多和較穩(wěn)定的多糖?？喙咸俅痔呛泻芏嘟M分，這些都有待進(jìn)一步研究。

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