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      超聲輔助提取兗州卷柏生物堿及其對H22肝癌細(xì)胞增殖抑制影響

      2013-12-06 07:14:12邱丹纓溫?fù)P敏謝永華余瓊瓊林文東
      食品工業(yè)科技 2013年10期
      關(guān)鍵詞:卷柏兗州固液

      邱丹纓,溫?fù)P敏,謝永華,蘇 齊,余瓊瓊,林文東

      (1.泉州醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校,福建泉州362011;2.福建省泉州市醫(yī)藥研究所,福建泉州362000)

      兗州卷柏(Selaginella involvens,Spring)為卷柏科植物兗州卷柏的全草,是多年生草本植物[1]。兗州卷柏具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、降血糖、增強人體免疫功能等作用[2-3]。生物堿是最古老的藥物之一,也是現(xiàn)今藥物的最主要來源之一。近年來,國內(nèi)外對各種生物堿的研究利用愈來愈深入。本文研究超聲波輔助乙醇法對兗州卷柏生物堿提取,設(shè)計正交實驗優(yōu)選出超聲波提取兗州卷柏生物堿的最佳條件,為兗州卷柏的進一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料與儀器

      兗州卷柏 采自福建寧化縣治平鄉(xiāng)泥坑村,由泉州市醫(yī)藥研究所蘇齊主任醫(yī)師鑒定;鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品 購自上海源葉生物科技有限公司;小鼠H22肝癌細(xì)胞株 購自天呈科技生物公司;DMSO,MTT,RPMI1640培養(yǎng)基,小牛血清 購自賽默飛世爾科技公司(北京);MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物公司;注射用環(huán)磷酰胺(CTX) 購自山西普德藥業(yè)有限公司(國藥準(zhǔn)字H14023686);氯仿 AR,天津市化學(xué)試劑一廠;無水乙醇 西隴化工股份公司;溴甲酚綠指示劑 稱取0.02g溴甲酚綠溶于1.43mL的0.02mol/L的NaOH溶液,雙蒸水稀釋至50mL;乙酸乙酸納緩沖液(pH=4.0) 稱取8.2g無水乙酸鈉,加23mL冰醋酸并稀釋至250mL。

      SP-752型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;VGT-1620QTD型超聲波清洗機 深圳市興宏業(yè)投資有限公司;RE5210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海予騰生物科技有限公司;KHBST-360型酶標(biāo)儀 上??迫A;HF-90型CO2培養(yǎng)箱 北京陽光思特生物技術(shù)有限公司。

      1.2 實驗方法

      1.2.1 生物堿提取工藝研究

      1.2.1.1 不同乙醇濃度對兗州卷柏生物堿提取的影響 取兗州卷柏全草除雜,水洗后曬干。放入粉碎機粉碎3min成粉末。稱取5g兗州卷柏粉末,放入500mL錐形瓶,再加入60%、70%、80%、90%和100%乙醇150mL于室溫浸泡24h。用功率30W,頻率34Hz超聲波處理40min后過濾,取上清液烘箱烘干。將烘干后的粉末,加入2%HCl溶液100mL浸泡12h后過濾,用氨水溶液調(diào)至pH=10。取上清液用于測定生物堿含量。另外,取分液漏斗依次加入上清液和氯仿萃取,反復(fù)萃取至無生物堿反應(yīng)為止,減壓蒸餾,回收氯仿得到生物堿粉末[4]。

      1.2.1.2 不同固液比對兗州卷柏生物堿提取的影響稱取5g兗州卷柏粉末,放入500mL錐形瓶,再加入固液比(g/mL)為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的70%乙醇于室溫浸泡24h。在功率30W,頻率34Hz超聲波處理40min后過濾,取上清液烘箱烘干。將烘干后的粉末,加入2%HCl溶液100mL浸泡12h后過濾,用氨水溶液調(diào)至pH=10。取上清液5mL用于測定生物堿含量。

      1.2.1.3 正交實驗對兗州卷柏生物堿提取的影響 在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上設(shè)計三因素三水平正交實驗,因素水平見表1。生物堿提取方法同1.2.1.1。

      表1 提取生物堿的實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of alkaloid extraction

      1.2.2 生物堿含量測定

      1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定 精確配制濃度為0.40、0.20、0.10、0.05、0.025mg/mL的鹽酸小蘗堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取不同濃度的鹽酸小蘗堿標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL置于分液漏斗中,接著加入2.5mL乙酸鈉緩沖液,再加入2.0mL溴甲酚綠指示液,振蕩5min,靜置分層20min。另外,取1mL雙蒸水,用同樣方法制備空白對照組。取氯仿層,以空白對照組調(diào)零,在415nm處測定吸光度[5]。以鹽酸小蘗堿濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=4.865x+0.140(R2=0.996)。

      1.2.2.2 樣品生物堿含量測定 取兗州卷柏提取液1mL,置于分液漏斗中,接著加入2.5mL乙酸鈉緩沖液,再加入2.0mL溴甲酚綠指示液,振蕩5min,靜置分層20min。另外,取1mL雙蒸水,用同樣方法制備空白對照組。取氯仿層,以空白對照組調(diào)零,在415nm處測定吸光度。按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算生物堿含量。

      生物堿提取率(%)=生物堿質(zhì)量/兗州卷柏粉末質(zhì)量×100 式(1)

      1.2.3 生物堿對肝癌細(xì)胞H22增殖抑制作用 采用MTT法[6]測定生物堿對H22肝細(xì)胞增殖抑制作用。H22肝癌細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液,在5%CO2、37℃飽和濕度條件下培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期細(xì)胞,分于96孔板,調(diào)整細(xì)胞濃度約6000個細(xì)胞每孔。每孔分別加入含生物堿0(空白對照組)、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mg/mL的培養(yǎng)液中培養(yǎng),另設(shè)一組含2mg/mL環(huán)磷酰胺(CTX)作為陽性對照。細(xì)胞分別培養(yǎng)12、24、48h。按MTT試劑盒說明書測定細(xì)胞抑制率。

      抑制率(%)=(1-實驗組吸光度/空白對照度吸光度)×100 式(2)

      2 結(jié)果與分析

      2.1 乙醇濃度對兗州卷柏生物堿提取的影響

      不同乙醇濃度對兗州卷柏生物堿提取的影響見圖1。從圖1可以看出,乙醇濃度小于70%時,生物堿提取率隨乙醇濃度增加而增多。而乙醇濃度大于70%以上,生物堿提取率隨乙醇濃度增加而減少。當(dāng)乙醇濃度為70%時,兗州卷柏生物堿提取率最多,達1.08%。

      圖1 乙醇濃度對生物堿提取率的影響Fig.1 Effect of different concentration of ethanol on extracting rate of alkaloids

      2.2 固液比對兗州卷柏生物堿提取的影響

      固液比對兗州卷柏生物堿提取的影響見圖2。從圖2可以看出,當(dāng)固液比小于1∶40g/mL時,隨著固液比增加兗州卷柏生物堿提取率迅速增高。但當(dāng)固液比大于1∶40g/mL時,繼續(xù)增加乙醇量,兗州卷柏生物堿提取率趨于穩(wěn)定。其原因可能是增加乙醇量有利于生物堿的溶解。但當(dāng)加乙醇量達到一定程度時,生物堿已全部溶解,所以繼續(xù)增加乙醇量生物堿提取率不再增加??紤]到固液比大,會給后續(xù)工序帶來困難,消耗較多熱能等,綜合各方面考慮,適宜的固液比為1∶40g/mL。

      圖2 固液比對生物堿提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extracting rate of alkaloid

      2.3 正交實驗優(yōu)化生物堿提取工藝

      表2 生物堿提取的正交實驗Table 2 Orthogonal experiment of extracting alkaloid

      表3 物堿提取的正交實驗方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment of extracting alkaloid

      通過預(yù)實驗選擇設(shè)計三因素三水平正交實驗,研究超聲波對生物堿提取的最佳條件。其結(jié)果見表2。從表2可以看出影響生物堿提取的首要因素是超聲功率,其次是超聲時間和超聲溫度(B>A>C)。根據(jù)方差分析(見表3),超聲功率和時間對生物堿提取影響顯著(p<0.05),而超聲溫度對生物堿提取有一定影響,但影響不顯著(0.05<p<0.10)。生物堿提取最佳工藝是超聲時間60min、超聲功率400W、超聲溫度60℃(A3B2C2)。驗證實驗表明,此時提取率達1.18%。

      2.4 生物堿對H22肝癌細(xì)胞增殖抑制作用

      兗州卷柏生物堿對H22肝癌細(xì)胞體外增殖抑制作用見圖3,從圖3可以看出細(xì)胞培養(yǎng)12h后,實驗組對H22肝癌細(xì)胞的抑制率均低于對照組(CTX組),但所有實驗組與對照組之間均無顯著差異(p>0.05)。細(xì)胞培養(yǎng)24h后,SIA4和SIA5對肝癌細(xì)胞抑制率高于對照組,且SIA5與對照組之間存在顯著差異(p<0.05)。細(xì)胞培養(yǎng)48h后,SIA3、SIA4和SIA5對肝癌細(xì)胞抑制率高于對照組,其中SIA4和SIA5與對照組之間存在顯著差異(p<0.05)。其中SIA5生物堿濃度為8mg/mL時,對肝癌細(xì)胞增殖抑制率達53.25%。

      圖3 生物堿對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.3 Effect of alkaloid on growth inhibition of hepatocellular carcinoma cell

      3 討論

      3.1 超聲波輔助兗州卷柏生物堿提取工藝影響

      生物堿有效成分的高效提取是中草藥開發(fā)的關(guān)鍵與難點,新技術(shù)的研究與開發(fā)能大大提高中草藥中生物堿的回收率與質(zhì)量,并節(jié)約大量的時間和能源。超聲波作為一種特殊的能量形式,作為一種新技術(shù)在中草藥有效成分的提取、藥物制劑工藝的改進、藥物的合成與降解、以及在生物藥劑中的運用等方面倍受青睞[7]。陳志慧等[8]用索氏回流、常規(guī)浸提、超聲波3種方法提取斷腸草總堿,結(jié)果表明,超聲波提取方法生物堿提取效率最高。金艷梅等[9]研究表明,75%乙醇對蒲公英生物堿提取效率最高。李俶等[10]研究表明,乙醇濃度為100%對槲寄生有效成分中生物堿的提取效率最高,而最佳的固液比是1∶30。本研究表明,對兗州卷柏生物堿提取率最高乙醇濃度為70%,而固液比為1∶40,其原因可能是,不同生物體所含生物堿種類有所差異,而不同生物堿在不同濃度乙醇中的溶解度不同。

      3.2 兗州卷柏生物堿對肝癌細(xì)胞增殖抑制作用

      兗州卷柏作為治療肝炎的中藥應(yīng)用已有悠久歷史,《福建民間草藥》記載:兗州卷柏具有清肝熱,療黃疸功效。林美珍等[11]使用兗州卷柏治療20例肝炎患者,得到顯著療效。在廣東仁化縣等地,民間使用兗州卷柏熬水內(nèi)服兩個療程(每一療程為7d)后,可以得到較顯著的療效[12]。張昊[2]研究充州卷柏的四種黃酮類化合物與抗肝癌藥物甲氨蝶吟(MTX)和人肝癌細(xì)胞HepG2的體外增殖抑制作用,結(jié)果表明,4種兗州卷柏黃酮類化合物對體外人肝癌細(xì)胞HePG2均有一定的抑制活性。其中化合物6-羥基-2-對羥基苯基-苯并毗喃酮-8-乙酸、4’-甲氧基羅伯斯特雙黃酮、羅伯斯特雙黃酮、穗花杉雙黃酮的抑制活性與MTX相近,而化合物羅伯斯特雙黃酮在不同濃度的抑制率和IC50值,都顯示出比陽性對照MTX具有更強的抑制活性。本實驗結(jié)果與以上實驗相似,兗州卷柏生物堿對小鼠肝癌H22細(xì)胞有顯著生長抑制效果。表明兗州卷柏含有抑制肝癌細(xì)胞的有效活性成分,其活性成分的鑒定及抗肝癌機制有待進一步研究。

      4 結(jié)論

      超聲輔助法是兗州卷柏生物堿提取的有效方法。最佳工藝為:乙醇濃度70%、固液比1∶40、超聲時間60min、超聲功率400W和超聲溫度60℃。影響生物堿提取的首要因素是超聲功率,其次是超聲處理時間和超聲溫度。不同濃度兗州卷柏生物堿對小鼠H22肝癌細(xì)胞均有抑制效果,其中生物堿濃度為8mg/mL時,培養(yǎng)48h對肝癌細(xì)胞增殖抑制率達53.25%。

      [1]江蘇新醫(yī)學(xué)院編.《中藥大辭典》[M].上冊.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,l446-l447.

      [2]張昊.兗州卷柏成分及抗腫瘤活性成分研究[D].長沙:中南大學(xué),2009.

      [3]溫?fù)P敏.兗州卷柏的研究進展[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2012,31(3):341-342.

      [4]Tie-shan Wang,Li-jing Chen,Zhao-yu Wang,et al.Purified alkaloid extract of Scutellaria barbata inhibits proliferation of hepatoma HepG-2 cells by inducing apoptosis and cell cycle arrest at G2/M phase[J].African Journal of Pharmacy and Pharmacology,2011,5(8):1046-1053.

      [5]王偉,譚曉梅.荷葉總生物堿含量測定方法的研究[J].中草藥,2004,27(1):50-51.

      [6]Hong Ye,Keqi Wang,Chunhong Zhou et al.Purification,antitumor and antioxidant activities in vitro of polysaccharidesfrom the brown seaweed sargassum pallidum[J].Food Chemistry,2008,111(2):428-432.

      [7]常明泉,彭小燕,陳學(xué)珍,等.超聲波技術(shù)在藥物開發(fā)研究中的應(yīng)用[J].中國藥事,2009,23(12):1221-1223.

      [8]陳志慧,周家容.不同提取方法對斷腸草總生物堿提取率的影響[J].農(nóng)藥,2007,46(3):176-177.

      [9]金艷梅,朱國軍.正交實驗法研究蒲公英中總生物堿提取工藝[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,34(3):329-330.

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      [11]林美珍,許振強.兗州卷柏識別及對肝炎的治療作用[J].海峽藥學(xué),2004,16(5):94-95.

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