β-1，3-1，4-葡聚糖酶在畢赤酵母中的克隆與表達

陳龍軍，陳濟琛，陳亞蘭，林戎斌，林新堅，*

（1.福建省農業(yè)科學院土壤肥料研究所，福建福州350000；2.廈門大學化學化工學院，福建廈門361005）

β-1，3-1，4-D-葡聚糖，是一種由D型β-葡萄糖苷通過β-1，3和β-1，4糖苷鍵連接而成的線性多糖；β-葡聚糖作為一種非結構性淀粉多糖，廣泛存在于高等植物的細胞壁中，如谷物類的大麥、小麥、燕麥、水稻等[1]。它有可溶性與非可溶性之分，可溶性β-葡聚糖在液體中具有高黏性、高親水性、高的吸水膨脹力和持水性、高吸附性；基于上述特性，給含有β-葡聚糖谷類作物的實際應用帶來一些負面影響。如在制造麥芽汁過程中，由于大量高分子β-葡聚糖存在，致使麥芽汁粘度增大，過濾困難；在發(fā)酵過程中過量的β-葡聚糖還會與蛋白質結合，使酵母早期沉淀。飼料工業(yè)中發(fā)現(xiàn)，存在于飼料中的β-葡聚糖由于自身的種種限制因素（高粘性、高親水性、高吸水活性及離子吸附性等）影響營養(yǎng)物質在動物體內的代謝，從而降低飼料的轉化率[2-3]。因此，β-1，3-1，4-葡聚糖酶作為專一、高效降解β-1，3-1，4-D-葡聚糖的一類酶，對解決含葡聚糖的谷類作物的工農業(yè)應用遇到的問題，起到至關重要的作用。目前國內外已克隆和表達了多種不同來源β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因[4-6]，并且國外已經實現(xiàn)了工業(yè)化。而國內對β-葡聚糖酶的研究雖取得了相當的進步，但是在工業(yè)化工程中仍然存在一些問題，如酶產量、穩(wěn)定性、及比活力等制約了其應用。本研究旨在構建篩選出β-1，3-1，4-D-葡聚糖酶畢赤酵母基因工程菌，提高酶活力及其熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性，為葡聚糖酶的工業(yè)化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌（Escherichia coli）JM109、含β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的質粒pLF3 均由廈門大學化學化工學院化工系盧英華老師課題組惠贈；Pichia pastoris X-33（畢赤酵母）、質粒pPICZαA Invitrogen公司；β-1，3-1，4-葡聚糖（地衣多糖） Sigma公司（St.louis，MO）；PCR試劑、限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、標準蛋白 TAKARA產品；質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒 廣州東盛生物科技有限公司；博來霉素 上海貝基生物科技有限公司；蛋白胨、酵母粉、YNB 上海生物工程技術服務有限公司；LB培養(yǎng)基 用于培養(yǎng)大腸桿菌；YPDS、BMGY/BMMY 用于培養(yǎng)誘導畢赤酵母；以上培養(yǎng)基具體配方 見Invitrogen公司的畢赤酵母操作手冊[7]。

1.2 實驗方法

1.2.1 β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因擴增 以經密碼子優(yōu)化合成的全基因glucanase為模板，在該基因兩端分別引入兩個酶切位點，EcoR I、Not I，設計一對引物如下：

BGL1：5’-CG GAATTC ATGAAACGAGTGTTG CT-3’

BGL2：5’-AAA GCGGCCGC ATTGCTCGTATAT TTTA-3’

PCR反應體系（50μL）：10×PCR緩沖液5μL，MgCl2（25mmol/L）3μL，dNTP（10mmol/L）1mL，兩條引物各1μL，模板1μL，Taq酶（10000U/mL）1μL，ddH2O 37μL。PCR反應程序如下：a.95℃ 4min；b.94℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 1min；c.重復步驟b 30次；d.72℃ 10min；e.4℃保存。PCR產物經過1.0%瓊脂回收預期大小的片段。與pMD-T-18載體連接，轉化入大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，涂布在含氨芐青霉素LB平板上，挑選陽性克隆，提質粒進行測序驗證，得pMD18-T-bgl。

1.2.2 畢赤酵母重組表達質粒的構建 將獲得的pMD18-T-bgl用EcoR I和Not I進行雙酶切，回收目的片段，并與同樣經過EcoR I和Not I雙切的載體pPICZαA進行16℃過夜連接，連接產物轉化感受態(tài)大腸桿菌JM109，涂布于含25μg/mL博來霉素的低鹽LB平板，37℃過夜培養(yǎng)后。挑選陽性克隆子提取質粒進行測序，并用EcoR I和Not I進行雙酶切驗證。

1.2.3 畢赤酵母重組菌的構建及篩選 取構建好的重組表達載體pPICZαA-bgl 20μL，經限制性內切酶Sac I在37℃下酶切16h，然后將酶切產物用無水乙醇沉淀，溶于10μL無菌水，加入到80μL畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，冰浴5min，在1500V電壓（25μF）條件下電擊轉化，迅速加入1mL 1mol/L的山梨醇，轉移到15mL空的無菌離心管中于30℃搖床下靜置培養(yǎng)2～3h，然后混勻分別適量涂布于含有100μg/mL博來霉素的YPDS抗性平板，30℃倒置培養(yǎng)2～4d，直至長出清晰菌落；隨機挑取若干個單克隆，提取酵母基因組DNA進行PCR驗證是否轉化成功。

1.2.4 重組畢赤酵母X-33搖瓶誘導表達 將轉化的畢赤酵母陽性克隆子，接種于25mL BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，離心收集菌體，加入25mL BMMY培養(yǎng)基后于30℃、250r/min繼續(xù)培養(yǎng)，每12h補加體積濃度為0.5%的甲醇，并取樣，離心得上清，即為粗酶液；測定β-1，3-1，4-D-葡聚糖酶活力（DNS法[8]）。酶的活力單位定義為：pH5.0，溫度為50℃下，每分鐘催化產生1μmol還原糖（葡萄糖）所需要的酶量，即為1U。

1.2.5 表達產物SDS-PAGE電泳 采用分離膠濃度12%，濃縮膠5%的SDS-PAGE，發(fā)酵液加入5×上樣緩沖液，沸水浴10min后上樣20μL進行電泳，參照文獻[9]進行。

1.2.6 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最適反應溫度測定在不同溫度下條件下按照常規(guī)法測定酶活力，以測得的最高酶活力為100%，其余條件下測得的酶活力換算成相對酶活。

1.2.7 β-1，3-1，4-葡聚糖酶對溫度的穩(wěn)定性測定在酶液50、60、70、80℃分別保溫30、60、90、120、150min，冷卻至室溫，按照常規(guī)法測定殘余酶活力，以未保溫酶液的酶活力為100%。

1.2.8 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最適反應pH測定 在不同pH緩沖液中按常規(guī)法測定酶活力，以測得的最高酶活力為100%，其余條件測得的酶活力換算成相對酶活。

1.2.9 β-1，3-1，4-葡聚糖酶對pH的穩(wěn)定性測定 將酶液與不同pH得緩沖液50℃下保溫1h，冷卻至室溫，測定酶活，以處理前測得的酶活力為100%。

圖1 重組質粒pPICZαA-bglFig.1 The constructed plasmid of pPICZαA-bgl

2 結果與分析

2.1 β-1，3-1，4-glucanase基因的獲取

圖2 β-1，3-1，4-glucanase基因擴增產物Fig.2 PCR product of β-1，3-1，4-glucanase gene

經過引物BGL1/BGL2擴增得到的陽性條帶大小在700bp左右，如圖2所示，與目的基因glucanase的大?。?17bp，編碼239個氨基酸）基本相符，測序驗證，至此成功獲得bgl基因。

2.2 重組表達載體的構建

將pMD18-T-bgl和載體pPICZαA分別經EcoR I和Not I雙酶切，回收相應片段，連接產物轉化大腸桿菌JM109，挑取轉化子擴增并抽提質粒。將抽提的質粒經EcoR I和Not I雙酶切，得到了700bp左右和3600bp左右的條帶（見圖3），證實bgl基因成功插入載體pPICZαA，將重組質粒命名為pPICZαA-bgl。

圖3 雙酶切驗證重組質粒pPICZαA-bglFig.3 Identification of pPICZαA-bgl by digested with EcoR Iand Not I

2.3 畢赤酵母的轉化和重組菌株的驗證

利用重組質粒pPICZαA-bgl上的AOX序列與畢赤酵母基因組上的同源序列進行重組，進而把外源基因整合入酵母染色體上。先用內切酶Sac I對重組質粒進行線性化，然后通過電轉化方法轉化感受態(tài)畢赤酵母細胞X-33。涂布于含100μg/mL博來霉素的YPDS瓊脂平板培養(yǎng)基進行初步篩選。隨機挑取若干菌株，用液氮破碎法提取酵母基因組作為模板，分別以AOX基因的引物（5’AOX1/3’AOX1）和bgl的引物（BGL1/BGL2）進行PCR驗證，如圖4所示，3～6泳道分別是以轉化子基因組為模板，泳道3引物AOX1/AOX2得兩個片段，分別為1300bp和2200bp，泳道4BGL1/BGL2為750bp，泳道5AOX1/BGL2為1200bp，泳道6 BGL1/AOX2為800bp左右，而泳道2以原始菌株X-33基因組為模板，引物為AOX1/AOX2得片段2200bp，均與預期大小一致，至此重組畢赤酵母構建成功，命名為X-33/pPICZαA-bgl。

圖4 PCR分析畢赤酵母陽性轉化子Fig.4 PCR analysis of the positive transformants

2.4 重組畢赤酵母X-33搖瓶誘導表達

挑取表達菌株接種于25mL BMGY的培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)約24h，離心收集菌體，用含0.5%的甲醇的新鮮BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，誘導表達。每隔12h取樣，測定酶活力及濕重，其產酶曲線如圖5所示。由圖5可知，在搖瓶發(fā)酵中，經甲醇誘導96h酶活力達到308.5U/mL，濕重為89.5g/L；96h之后產酶速率趨于平緩。因此甲醇誘導96h為最佳誘導時間。

圖5 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的誘導表達Fig.5 Expression of β-1，3-1，4-glucanase

2.5 SDS-PAGE電泳檢測表達產物

發(fā)酵液上清（用TCA法濃縮10倍）溶于5×上樣緩沖液，SDS-PAGE檢驗，結果見圖6。從圖6中可見在約33ku有一條帶，而陰性對照中沒有相應條帶。此條帶與β-1，3-1，4-葡聚糖酶理論分子量（26.6ku）相比稍大，究其原因可能是蛋白表達過程中引起畢赤酵母的糖基化作用，導致目的蛋白比理論分子量偏大。

圖6 重組X-33表達產物SDS-PAGE電泳結果Fig.6 SDS-PAGE analysis of recombinant P.pastoris X-33 culture supernatant

2.6 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的穩(wěn)定性

2.6.1 溫度對β-1，3-1，4-葡聚糖酶的影響 從圖7中可看出，在不同溫度條件下，當低于50℃時，酶活力隨著溫度的增加而增加；當溫度達到50℃時，相對酶活力達到最高；當溫度大于50℃，酶活力逐漸下降；高于55℃時，酶活力下降顯著。由此可知，該酶的最適反應溫度為50℃，在40～55℃之間具有較高的酶活性。

圖7 溫度對β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性的影響Fig.7 Effect of temperature onβ-1，3-1，4-glucanase activity

2.6.2 葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性 由圖8可看出，葡聚糖酶在50～80℃范圍內分別保溫不同時間內的酶活力的變化趨勢基本一致，均逐步下降；隨著溫度的增加和儲存時間的延長，酶活力損失逐漸增大，然而在50℃下保溫150min后，相對酶活仍達到95.4%，而70℃下保溫30min酶活下降至38.5%，因此該酶在50℃下具有較好的熱穩(wěn)定性。

圖8 溫度對β-1，3-1，4-葡聚糖酶穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of temperature on β-1，3-1，4-glucanase stability

2.6.3 pH對β-1，3-1，4-葡聚糖酶的影響 pH對酶活的影響如圖9所示，葡聚糖酶活力在pH5.0時達到最大值。在pH4.5～6.0范圍內相對酶活力均高于65%；當pH大于6.0后，酶活力迅速下降；pH7時，酶活力只有31.1%，說明堿性條件下酶活性較低。

2.6.4 葡聚糖酶對不同pH的耐受性 β-1，3-1，4-葡聚糖酶經不同的酸堿處理1h后，結果如圖10所示。在pH3～7之間酶活力均能保持在80%以上，由此可見，在不同的酸堿條件下酶均能保持較好的穩(wěn)定性。

圖10 溫度對β-1，3-1，4-葡聚糖酶穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effect of temperature on β-1，3-1，4-glucanase stability

3 結論與討論

β-葡聚糖酶作為一種重要的工業(yè)用酶，其應用已擴展到釀酒工業(yè)、飼料工業(yè)、醫(yī)藥紡織等各個領域中，具有廣闊的應用前景。β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因在原核大腸桿菌中已有表達研究的報道[10-11]，本研究運用真核表達系統(tǒng)，對β-1，3-1，4-葡聚糖酶的進一步進行密碼子偏好性優(yōu)化，運用基因工程手段成功實現(xiàn)了其在畢赤酵母系統(tǒng)中的高效分泌表達，其初篩的搖瓶酶活力高達308.5U/mL，比優(yōu)化密碼子前活力提高了近3倍，誘導時間為96h；經SDS-PAGE電泳，實際蛋白分子量約為33ku，比理論分子量稍大，究其原因可能是該基因的四個糖基化位點（Asn56-Cys-Thr，Asn63-Val-Ser，Asn89-Arg-Ser，Asn210-Gly-Thr），引起畢赤酵母的糖基化作用，從而導致目的蛋白比理論分子量偏大。此外，對酶學性質進行了初步探討，該酶最適反應溫度為50℃，最適反應pH為5.0，在酸性條件下具有較好的穩(wěn)定性。

畢赤酵母作為高效表達外源蛋白的表達系統(tǒng)，高密度發(fā)酵是其重要特點，而且其胞外分泌的雜蛋白少，有利于后期目的蛋白的分離純化。今后將對該工程菌進行搖瓶及發(fā)酵罐放大優(yōu)化，探索目的蛋白純化工藝，為中試及后期應用奠定基礎。此外，考慮到甲醇型畢赤酵母在生產上的安全性問題及其產品在食品應用方面的局限性，對酵母生產及產品分離純化提出了更高要求；為消除甲醇影響、拓展葡聚糖酶應用、簡化生產工藝及提高生產效率，后期將考慮以組成型畢赤酵母為實驗菌，用甘油替代甲醇實現(xiàn)葡聚糖酶的生產。

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