李瑞銳,尹文琴,李 磊,王 麗,陳麗君,戴金鳳
(南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,江蘇南京211166)
大量人群流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究表明,自由基參與機(jī)體多種疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程,是血管損傷、細(xì)胞癌變、神經(jīng)病變的原始引發(fā)機(jī)制之一[1-3]。清除自由基、提高機(jī)體抗氧化能力,是許多藥物防治慢性疾病的重要途徑[4-5]??Х人峒捌溲苌飳儆诙喾宇?lèi)植物化學(xué)物。多酚類(lèi)植物化合物對(duì)心腦血管、糖尿病腎病及癌癥等慢性非傳染性疾病具有很好的預(yù)防作用[6-8]。CADs廣泛存在于以唇形科、菊科、薔薇科、十字花科等植物性食品或膳食中[9-12]。食用富含CADs的食物對(duì)心腦血管疾病、細(xì)胞損傷惡變引發(fā)的腫瘤等有一定的防治作用[13-14]。目前,CADs單體的抗氧化、抗菌、抗腫瘤、保肝等多方面的生物活性已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)[15-17],但多種CADs對(duì)機(jī)體的聯(lián)合保護(hù)作用研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選用食品/膳食中常見(jiàn)的三種CADs,運(yùn)用DPPH自由基、·OH反應(yīng)模型和CuSO4-Phen-VitC-H2O2-DNA化學(xué)發(fā)光體系,研究其清除自由基及對(duì)·OH自由基致DNA損傷的保護(hù)作用。探討膳食復(fù)雜體系中多種植物化學(xué)成分防治慢性非傳染性疾病作用效果,為植物化學(xué)物整合作用研究和膳食干預(yù)提供依據(jù)。
綠原酸(ChA,純度99%)、阿魏酸(FeA,純度99%)、迷迭香酸(RoA,純度99%)、維生素C(VitC)、小牛胸腺DNA 美國(guó)Sigma公司;DPPH(純度95%)、鄰啡咯啉(Phen) Johnson Mathey公司;甲醇 色譜純;過(guò)氧化氫(30%)、乙醇、甲醇、醋酸銨、濃鹽酸、硫酸銅 均為分析純。
Orion II高靈敏度板式化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀 德國(guó)BertholdDS公司;InfiniteM200熒光酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司;梅特勒MS105DU分析天平 德國(guó)賽多利斯公司;SSW型電熱恒溫水槽 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;XW-80A微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠;KQ3200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。
1.2.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[17],DPPH溶液和樣品質(zhì)量濃度梯度的配制(DPPH溶液現(xiàn)配現(xiàn)用):精確配制質(zhì)量濃度為720μg/mL DPPH溶液作為儲(chǔ)備液。應(yīng)用時(shí),將儲(chǔ)備液用甲醇稀釋15倍,質(zhì)量濃度為48μg/mL。實(shí)驗(yàn)分為8組(ChA、FeA、RoA、ChA+FeA(1∶1)、ChA+RoA(1∶1)、FeA+RoA(1∶1)、ChA+FeA+RoA(1∶1∶1)、VitC)。每組都分為200、100、50、25μg/mL四個(gè)濃度。
反應(yīng)體系及清除率計(jì)算:將100μL不同質(zhì)量濃度的樣品和等量的DPPH自由基分別加入96孔板中,每孔反應(yīng)體積共200μL液體,每個(gè)質(zhì)量濃度3個(gè)平行樣,每隔2min測(cè)一次吸光度(Aj),空白為A0(200μL甲醇),陰性對(duì)照Ai(100μL DPPH·+100μL甲醇),陽(yáng)性對(duì)照(100μL DPPH+100μL VitC),按式(1)計(jì)算DPPH清除率。
1.2.2 ·OH清除率的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[18],用0.1mol/L醋酸鹽緩沖液(pH5.5)配制CuSO4-Phen-VitC溶液,在化學(xué)發(fā)光儀微孔板中依次加入CuSO4-Phen-VitC混合液100μL、不同組合CADs溶液60μL、H2O220μL。對(duì)照組用60μL緩沖液補(bǔ)齊,每組做3個(gè)平行樣,立即測(cè)定發(fā)光反應(yīng)值。根據(jù)發(fā)光值繪制發(fā)光反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線,以曲線峰值計(jì)算·OH清除率,觀察不同組合CADs對(duì)·OH的清除作用。不同組合CADs樣品孔發(fā)光強(qiáng)度以CLj表示,醋酸鹽緩沖液對(duì)照組發(fā)光強(qiáng)度以CLi表示?!H清除率計(jì)算公式見(jiàn)式(2)。
1.2.3 CADs對(duì)·OH致DNA損傷的保護(hù)作用 參照文獻(xiàn)[19],用0.1mol/L醋酸鹽緩沖液(pH5.5)配制CuSO4-Phen-VitC-DNA溶液。在化學(xué)發(fā)光儀微孔板中依次加入CuSO4-Phen-VitC-DNA混合液、100μL、60μL不同組合的植物化學(xué)物溶液(對(duì)照組用60μL緩沖液補(bǔ)齊),最后加入20μL H2O2啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng),立即測(cè)定發(fā)光反應(yīng)值(CL)。每組做3個(gè)平行試樣。以DNA損傷產(chǎn)生的鳥(niǎo)嘌呤特征性化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度及峰值出現(xiàn)時(shí)間的變化,觀察不同組合多酚類(lèi)植物化學(xué)物作用下抑制DNA損傷的情況。
不同濃度的CADs對(duì)DPPH自由基均有清除作用見(jiàn)表1。在相同的作用時(shí)間內(nèi),在25~200μg/mL內(nèi)CADs對(duì)DPPH自由基的清除率逐漸增加,并且質(zhì)量濃度越大清除率越高。但在100μg/mL后,各種質(zhì)量濃度的CADs對(duì)自由基的清除率變化不明顯。
表1 CADs對(duì)DPPH自由基的清除率(%±SD,n=3)Table 1 The change in scavenging rate of CADs against DPPH free radicals(%±SD,n=3)
表1 CADs對(duì)DPPH自由基的清除率(%±SD,n=3)Table 1 The change in scavenging rate of CADs against DPPH free radicals(%±SD,n=3)
注:*,與同濃度VitC作用比較,有顯著性差異(p<0.05);#,與同濃度ChA+FeA+RoA作用比較,有顯著性差異(p<0.05)。
名稱(chēng)濃度(μg/mL)25 50 100 200 ChA 12.99±0.38 34.41±0.24* 68.46±0.14*# 69.01±0.23 FeA 17.74±0.25 49.30±0.92* 60.29±0.19*# 65.51±0.18 RoA 8.47±2.19 28.83±1.41* 52.99±0.79*# 57.53±1.24 ChA+FeA 19.80±1.25 47.71±1.75* 80.64±1.32*# 81.89±1.19 ChA+RoA 21.93±1.23 38.93±1.45* 74.63±1.03*# 74.61±1.12 FeA+RoA 20.39±1.32 38.39±1.35* 76.39±0.45*# 76.93±1.47 ChA+FeA+RoA 28.93±1.12 58.39±0.49* 83.93±0.54* 84.09±0.75 VitC 13.39±0.48 32.99±0.87 72.33±1.68 72.99±0.83
相同質(zhì)量濃度下,兩種CADs聯(lián)用組合以及三種CADs聯(lián)用組合的DPPH自由基的清除率大于單成分組。其中三種CADs聯(lián)用對(duì)DPPH自由基清除能力最強(qiáng)。當(dāng)ChA+FeA+RoA組合質(zhì)量濃度為200μg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到84.09%。實(shí)驗(yàn)證明多成分聯(lián)用的效果在對(duì)DPPH自由基清除率的能力明顯強(qiáng)于單一成分以及兩種成分聯(lián)用,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所選的三種多酚類(lèi)植物化學(xué)物之間存在著一定的協(xié)同作用。
CADs的濃度越大發(fā)光峰值越小,則其對(duì)·OH自由基的清除率越大。表2為各個(gè)實(shí)驗(yàn)組合在不同濃度下對(duì)·OH自由基的清除率。不加CADs溶液的空白對(duì)照組的發(fā)光峰值相對(duì)較高,實(shí)驗(yàn)組因加入不同組合CADs化學(xué)發(fā)光峰值很低,發(fā)光峰值下降程度明顯,則其對(duì)·OH自由基的清除率大下降程度明顯。相同質(zhì)量濃度下組合(ChA+FeA+RoA)對(duì)·OH自由基清除作用最強(qiáng),其中當(dāng)組合(ChA+FeA+RoA)濃度為25、50、100、200μg/mL時(shí),對(duì)發(fā)光峰的抑制率分別33.43%、55.27%、71.23%、77.49%,顯示了CADs對(duì)·OH自由基具有明顯的清除作用,且呈劑量效應(yīng)關(guān)系,即CADs質(zhì)量濃度越大發(fā)光峰值下降程度越明顯。多成分聯(lián)用更加有效的提高了CADs防止羥自由基引起的DNA損傷的效果。
表2 CADs對(duì)·OH自由基的清除率(%±SD,n=3)Table 2 The change in scavenging rate of CADs against·OH free radicals(%±SD,n=3)
表2 CADs對(duì)·OH自由基的清除率(%±SD,n=3)Table 2 The change in scavenging rate of CADs against·OH free radicals(%±SD,n=3)
注:*,與同濃度空白對(duì)照比較,有顯著性差異(p<0.05);#,與同濃度ChA+FeA+RoA作用比較,有顯著性差異(p<0.05)。
名稱(chēng)濃度(μg/mL)25 50 100 200空白對(duì)照 11.46±0.15 13.73±0.21 15.11±0.32 19.74±0.45 ChA 19.79±0.38 23.92±0.24* 38.46±0.14* 49.01±0.71 FeA 17.77±0.25 28.49±0.92* 40.29±0.13* 45.51±0.78 RoA 18.47±2.19 25.21±0.71* 42.99±0.22* 47.53±1.24 ChA+FeA 29.30±1.52 35.24±0.75*# 60.64±1.32*# 61.89±1.14 ChA+RoA 27.94±1.23 34.27±1.54*# 64.63±1.21*# 65.61±1.21 FeA+RoA 25.39±1.32 41.38±1.35*# 66.39±0.47*# 66.93±1.74 ChA+FeA+RoA 33.43±0.72 55.27±0.49* 71.23±0.54* 77.49±0.75
如表3所示,不同質(zhì)量濃度的CADs加入CuSO4-Phen-VitC-H2O2-DNA體系后,各實(shí)驗(yàn)組對(duì)DNA損傷產(chǎn)物發(fā)光抑制率。
由表3可看出,不同比例的CADs均能有效防止羥自由基引起的DNA損傷。CADs能使DNA損傷產(chǎn)物發(fā)光峰較空白對(duì)照組有明顯下降;CADs的濃度越大發(fā)光峰值下降程度明顯,其對(duì)DNA損傷產(chǎn)物發(fā)光抑制率越大。不同組CADs對(duì)DNA損傷產(chǎn)物發(fā)光抑制率為12.49%~81.09%。其中三種成分聯(lián)用組的作用最強(qiáng),對(duì)DNA損傷產(chǎn)物發(fā)光抑制率高達(dá)81.09%。
表3 不同組合CADs對(duì)CuSO4-Phen-VitC-H2O2-DNA體系化學(xué)發(fā)光的影響Table 3 Effect of different group of CADs at various concentrations on chemiluminescence intensity of CuSO4-Phen-VitC-H2O2-DNA system
本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用DPPH和·OH自由基反應(yīng)模型和酶標(biāo)儀觀察不同組合CADs對(duì)自由基的淬滅效應(yīng)。DPPH自由基是一種合成的有機(jī)自由基。通過(guò)對(duì)DPPH這種能穩(wěn)定存在的自由基清除能力的檢測(cè),可以反映樣品在體內(nèi)清除DPPH自由基的活性[20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CADs有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力。多種CADs聯(lián)合使用顯示出了協(xié)同清除DPPH自由基的能力。用CuSO4-Phen-VitC-H2O2-DNA化學(xué)發(fā)光體系測(cè)定不同組合CADs對(duì)·OH致DNA損傷的協(xié)同抑制作用[21],結(jié)果表明,不同組合CADs能有效清除DPPH和·OH自由基,聯(lián)用應(yīng)用能協(xié)同抑制·OH引發(fā)的DNA氧化損傷程度。
自由基的生成與許多疾病密切相關(guān),如衰老、心臟病、動(dòng)脈硬化、靜脈炎、關(guān)節(jié)炎、過(guò)敏、早老性癡呆、冠心病及癌癥等[22-24]。多酚類(lèi)植物化學(xué)物是一類(lèi)天然抗氧化劑,具有抗炎、抗氧化、消除自由基作用與免疫抑制等多種藥理作用[25]。多種成分多酚類(lèi)植物化學(xué)物聯(lián)合抗氧化和抑制自由基的課題日益成為研究熱點(diǎn)。
本研究結(jié)果表明,多成分CADs聯(lián)用較單一成分具有更好的保護(hù)機(jī)體DNA氧化損傷的作用。但由于本實(shí)驗(yàn)局限于體外模型,對(duì)CADs聯(lián)合在體內(nèi)的代謝及吸收機(jī)制還不很明確,體內(nèi)清除自由基及對(duì)DNA的氧化損傷作用還有待進(jìn)一步研究。
[1]Petersen M,Simmonds.Rosmarinic acid[J].Phytochemistry,2003,2(2):121-125.
[2]Bagchi K,Puri S.Free radicals and antioxidants in health and disease[J].Eastern Mediterranean Health Journal,2008,4(2):350-360.
[3]屠幼英,楊于銀,東方飛.紅茶中多酚類(lèi)物質(zhì)的抗氧化機(jī)制及其構(gòu)效關(guān)系[J].中草藥,2007,38(10):1581.
[4]趙海田,王振宇,程翠林,等.松多酚類(lèi)活性物質(zhì)抗氧化構(gòu)效關(guān)系與作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2012,33(2):458-461.
[5]張欣,趙新淮.幾種多酚化合物抗氧化性的不同化學(xué)評(píng)價(jià)及相關(guān)性分析[J].食品科學(xué),2008,29(10):85-89.
[6]張偉農(nóng),劉大川,胡小泓.葵花籽仁中提取綠原酸的研究[J].中國(guó)油脂,2002,27(2):76.
[7]Lu HT,Jiang Y,Chen F.Application of preparative high-speed counter-counter chromatography for separation of chlorogenic acid from Flos Loncease[J].J Chromatogra,2004,1026:185.
[8]趙琳,張英鋒,馬子川.阿魏酸的合成和應(yīng)用[J].化學(xué)教育2009(7):5-7.
[9]陳慧芳,馬永華,卞學(xué)偉.植物活性成分辭典[M].第二冊(cè).北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2001:888-890.
[10]韓宏星,宋志宏,屠鵬飛.迷迭香水溶性成分研究[J].中草藥,2001,32(10):877.
[11]吳建章,郁建平,趙東亮.迷迭香酸的研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2005,17(3):383-388.
[12]Hirata T,Kobayashi T,Wada A,et al.Anti-obesity compounds in green leaves of Eucommia ulmoides[J].Bioorg Med Chem Lett,2011,21(6):1786-1791.
[13]孫峋,汪靖超,李洪濤,等.迷迭香酸的抗菌機(jī)理研究[J].青島大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2005,18(4):41-43.
[14]Ito N,Yabe T,Gamo Y,et al.Rosmarinic acid from Perillae Herba produces an antidepressant-like effect in mice through cell proliferation in the hippocampus[J].Biol Pharm Bull,2008,31(7):1376-1380.
[15]侯晉,付杰,張志明,等.咖啡酸衍生物的生物活性與化學(xué)結(jié)構(gòu)的改造[J].復(fù)旦學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2011,38(6):546-552.
[16]Rastija V.QSAR study of antioxidant activity of wine polyphenols[J].European Journal of Medicinal Chemistry,2009,44:400-408.
[17]許申鴻,杭瑚.溶劑及pH對(duì)1,1-二苯基-2-苦肼基自由基分析法的影響[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2010,19(3):50-52.
[18]胡天喜.測(cè)量活性氧、自由基及脂質(zhì)過(guò)氧化的化學(xué)發(fā)光技術(shù)[M].北京:原子能出版社,2007:65-71.
[19]趙珺,王麗,李磊,等.芹菜素對(duì)自由基致DNA損傷的保護(hù)作用及機(jī)制[J].食品科學(xué),2011,29(13):1-4.
[20]Youn J,Lee KH,Won J,et al.Beneficial effects of rosmarinic acid on uppression of collagen induced arthritis[J].The Journal of Rheumatology,2003,30(6):1203.
[21]Ramos AA,Marques F,F(xiàn)ernandes-ferreira M,et al.Water extracts of tree Hypericum sps.protect DNA from oxidative and alkylating damage and enhance DNA repair in colon cells[J].Food Chem Toxicol,2012,51:80-86.
[22]Scheckel KA,Degner SC,Romagnolo DF.Rosmarinic acid antagonizes activator protein-l-dependent activation of cyclooxygenase-2 expression in human cancer and nonmalignant cell lines[J].Journal of Nutrition,2008,138(11):2098-2105.
[23]Aboulenein HY,Kruk I,Kladna A,et al.Scavenging effects of phenolic compounds on reactive oxygen species[J].Biopolymers,2007,86(3):222-230.
[24]Lee HJ,Cho HS,Park E,et al.Rosmarinic acid protects human dopaminergic neuronal cells against hydrogenperoxideinduced apoptosis[J].Toxicology,2008,25(2):109-115.
[25]Vostálová J,Zdarilová A,Svobodová A.Prunella vulgaris extract androsmarinic acid prevent UVB-induced DNA damage and oxidative stress in HaCaT keratinocytes[J].Arch Dermatol Res,2010,302(3):171-181.