葡萄酒泥酵母超氧化物歧化酶分離提取工藝條件優(yōu)化

杜 娜，楊學(xué)山，韓舜愈，祝 霞，付文力，王 婧，盛文軍，張 波

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070)

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD，EC1，15，1，1)是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種胞內(nèi)金屬酶，可催化超氧陰離子(superoxideanions，O2－·)與H+發(fā)生歧化反應(yīng)，解除O2－·對機體的毒害［1］。因此，SOD制劑已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品及化妝品領(lǐng)域［2］。自1969年 Mccord從牛血中發(fā)現(xiàn)SOD以來，人們已從豬、牛、馬等動物紅細胞、肌肉、肝臟組織以及植物和微生物中分離化出SOD，其中利用微生物生產(chǎn)SOD具有成本低、周期短、適用于規(guī)?；a(chǎn)和所得產(chǎn)品安全性高等特點［3－6］。研究證實，真核微生物的SOD含量一般高于原核微生物，其中酵母菌含有豐富的線粒體，呼吸系統(tǒng)最完整，因而SOD含量高于其它絲狀真菌，可以作為 SOD的主要生產(chǎn)菌種［7－8］。葡萄酒泥是葡萄酒釀造過程中的主要副產(chǎn)物，含有大量的酵母細胞［9］。據(jù)統(tǒng)計，2011年我國葡萄酒年產(chǎn)量已達123.2萬t，加工各個階段產(chǎn)生酒泥量約占總加工量的4%～5%［10］。但目前國內(nèi)葡萄酒泥酵母尚未得到充分利用，大多數(shù)企業(yè)將其作為飼料、肥料，附加值很低，有一些甚至作為垃圾傾倒，不僅污染環(huán)境，而且浪費了寶貴的生物資源［11］。因此，利用葡萄酒泥酵母生產(chǎn)SOD，有較大的經(jīng)濟意義和社會意義。酵母具有較為堅固的細胞壁，破壁效果直接影響SOD的分離提取。蘇昕等［12］研究了發(fā)酵培養(yǎng)Y12酵母菌分離制備酵母SOD，并對其部分酶學(xué)性質(zhì)進行了深入的探討;廖湘萍等［13］采用異丙醇破壁法對啤酒酒泥酵母生產(chǎn)SOD進行了研究;王歲樓等［14］采用甲苯破壁法從活性干酵母中直接提取SOD，但利用葡萄酒泥酵母純化SOD尚未見報道。甲苯可溶解酵母細胞膜磷脂層，改變細胞膜結(jié)構(gòu)，提高細胞膜的通透性，從而使胞內(nèi)物質(zhì)釋放使［15］。因此，本實驗以葡萄酒泥酵母為原料，采用效果較好的甲苯法對酵母細胞進行破壁，并通過正交實驗優(yōu)化提取工藝參數(shù)，以期建立較為高效的技術(shù)路線，為葡萄酒泥酵母的資源化利用提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄酒酵母泥 甘肅祁連葡萄酒業(yè)有限公司;牛血清白蛋白 pharmacia公司;SOD活性測定試劑盒 南京建成生物工程有限公司;甲苯、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、EDTA、檸檬酸、Na2HPO4－12H2O、考馬斯亮藍等常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

SL－1001電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;TDZ5－WS離心機 湖南儀離心機儀器有限公司;HH－6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;PHS－3C pH計 上海雷磁有限公司;808型紫外－可見分光光度計 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄酒泥酵母SOD提取技術(shù)路線 葡萄酒泥→預(yù)處理→收集濕酵母→加入甲苯→熱處理→加入磷酸鹽緩沖液→室溫浸提→離心→熱變性→離心→提取液→SOD活性及蛋白質(zhì)含量測定。

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 葡萄酒泥酵母預(yù)處理 將葡萄酒酒泥與蒸餾水以1∶1混合，用80目篩篩分，4000r/min離心20min。重復(fù)上述步驟，直至所得沉淀為白色，上清液無色透明為止，收集沉淀備用。

1.2.2.2 甲苯破壁 1g濕酵母中加入0.8mL的甲苯溶液，35℃保溫 45min后，加入 pH7.8、0.05mol/L的磷酸緩沖液(含0.1mmol/L EDTA)3mL，室溫浸提5h，4000r/min離心15min，收集上清液。

1.2.2.3 熱變性 收集的上清液置于55℃水浴鍋中熱處理15min，4000r/min離心15min，除去雜蛋白，即得SOD酶液。取樣進行SOD活性及蛋白質(zhì)含量測定。

1.2.3 單因素實驗設(shè)計

1.2.3.1 甲苯用量對SOD提取的影響 稱取5份各2g 濕酵母細胞，分別加入0.8、1.6、2.4、3.2、4mL 甲苯，35℃保溫處理45min，加入0.05mol/L、pH7.8磷酸鹽緩沖液6mL，攪拌均勻后在室溫條件下浸提5h，離心、熱變性去除雜蛋白。測定SOD活性及蛋白質(zhì)含量。

1.2.3.2 甲苯作用時間對SOD提取的影響 稱取5份各2g濕酵母細胞，加入0.8mL甲苯，35℃條件下分別處理 15、25、35、45、55min，加入 0.05mol/L、pH7.8磷酸鹽緩沖液6mL，攪拌均勻后在室溫條件下浸提5h，離心、熱變性去除雜蛋白。測定酶活性及蛋白質(zhì)含量。

1.2.3.3 甲苯作用溫度對SOD提取的影響 稱取5份各2g濕酵母細胞，加入0.8mL的甲苯，分別在30、35、40、45、50℃ 保溫處理 35min 后，加入 pH7.8、0.05mol/L磷酸鹽緩沖液6mL，攪拌均勻在室溫條件下浸提5h，離心、熱變性去除雜蛋白。測定酶活性及蛋白質(zhì)含量。

1.2.3.4 磷酸緩沖液pH對SOD提取的影響 稱取5份各2g濕酵母細胞，分別加入甲苯0.8mL，45℃保溫處理 35min，依次加入 pH7.2、7.4、7.6、7.8、8.0 的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液6mL，攪拌均勻后在室溫條件下浸提5h，離心、熱變性去除雜蛋白。測定SOD活性及蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 正交實

驗優(yōu)化 根據(jù)單因素實驗結(jié)果確定葡萄酒泥酵母中提取SOD的正交實驗因素和水平，采用L9(34)正交實驗設(shè)計，優(yōu)化SOD提取工藝，平行重復(fù)3次。

表1 L9(34)正交實驗因素水平表Table 1 Factors and their levels in L9(34)orthogonal array design

1.2.5 蛋白質(zhì)含量測定 本實驗采用馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量［16］。通過實驗數(shù)據(jù)繪制的蛋白質(zhì)標準曲線線性回歸方程為:y=0.0049x－0.0069(R2=0.9989)。符合測定要求。

1.2.6 SOD酶活力測定 采用SOD活性測定試劑盒進行。根據(jù)蛋白質(zhì)含量和酶活力測定值計算比活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果與分析

2.1.1 甲苯用量對SOD提取的影響 由圖1可知，甲苯用量不同時，所提取的SOD酶比活力不同。當甲苯用量為0.8mL/g時，SOD的比活力最高，提取效果最好，所以選擇0.8mL/g為SOD提取的較佳甲苯用量。這主要是由于當甲苯用量不足時，酵母細胞壁沒有得到充分破碎，導(dǎo)致SOD釋放不完全;過量的甲苯會影響SOD活性，導(dǎo)致酶比活力下降。

圖1 甲苯用量對SOD比活力的影響Fig.1 Effect of different amount of toluene on the activity of SOD

2.1.2 甲苯作用時間對SOD提取的影響 由圖2可知，甲苯作用時間不同，提取的SOD比活力不同。其中，甲苯作用時間為35min時所提取的SOD酶比活力最高，所以應(yīng)選擇35min為較佳甲苯作用時間。當甲苯用量一定時，較短的作用時間，使酵母細胞壁破碎不充分，提取物中SOD含量較低，導(dǎo)致比活力較低;而較長的作用時間，雖然酵母細胞壁破碎較為充分，但也會導(dǎo)致酵母細胞中其他蛋白組分溶出，影響酶比活力。

圖2 甲苯作用時間對SOD比活力的影響Fig.2 Effect of different wall－broken time on the activity of SOD

2.1.3 甲苯作用溫度對SOD提取的影響 由圖3可知，當加入一定量的甲苯后，作用溫度不同時，所提取的SOD酶比活力存在差異。其中，當作用溫度為45℃時，所提取的 SOD酶比活力最高，所以選擇45℃為甲苯作用的最佳溫度。這是由于溫度過低時，不利于甲苯對酵母細胞壁的破碎，使SOD不能充分釋放;溫度過高，影響SOD穩(wěn)定性，導(dǎo)致比活力下降。

圖3 甲苯作用溫度對SOD比活力的影響Fig.3 Effect of different temperature on the activity of SOD

2.1.4 磷酸緩沖液pH對SOD提取的影響 由圖4可知，當磷酸緩沖液pH為7.8時，SOD的比活力最高，提取效果最好，所以選擇pH7.8為SOD提取的較佳磷酸緩沖液pH。當磷酸緩沖液pH小于或大于7.8時，都會使所得到的SOD比活力下降，造成這一結(jié)果的原因可能是不同pH條件下SOD的活性存在差異，進而影響所得SOD酶比活力。

圖4 磷酸緩沖液pH對SOD比活力的影響Fig.4 Effect of different pH of phosphate buffer on the activity of SOD

2.2 正交實驗結(jié)果與分析

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以SOD比活力為考察指標，進行了L9(34)正交實驗，實驗結(jié)果見表2。通過直觀分析和方差分析得到最優(yōu)組合，進行驗證實驗，確定甲苯法提取SOD的最優(yōu)工藝。

由表2的數(shù)據(jù)結(jié)果可得出影響甲苯法提取葡萄酒酒泥酵母SOD因素的主次順序為:A＞C＞B＞D。甲苯法提取葡萄酒酒泥酵母SOD正交實驗的最優(yōu)組合是 A2B1C3D3，即甲苯用量 0.8mL/g，作用時間25min，作用溫度50℃，磷酸緩沖液pH8.0。

表2 L9(34)正交實驗設(shè)計及結(jié)果表Table 2 L9(34)orthogonal array design arrangement and experimental results

用spss17.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行方差分析，其結(jié)果見表3。

表3 正交實驗方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variances for extraction yield of polysaccharides with various extraction conditions

由表3可知，甲苯用量、作用時間、作用溫度對SOD比活力影響顯著(p＜0.05)，對實驗結(jié)果影響較大。

2.3 驗證實驗結(jié)果

因正交實驗得到的最優(yōu)組合在L9(34)中未出現(xiàn)，需對最優(yōu)組合進行驗證實驗。在甲苯用量0.8mL/g，作用時間25min，作用溫度50℃，磷酸緩沖液pH8.0的條件下提取SOD。重復(fù)3次，SOD平均酶比活力為178.73U/mg，比正交實驗中最優(yōu)組合得到的酶比活力高。

3 結(jié)論

本實驗以葡萄酒酒泥酵母為原料，通過L9(34)正交實驗確定的最優(yōu)工藝參數(shù)為甲苯用量0.8mL/g，作用時間25min，作用溫度50℃，磷酸緩沖液pH8.0，在此條件下提取 SOD，所得 SOD平均比活力為178.73U/mg。

甲苯雖然具有一定毒性，但可通過后續(xù)的離子交換層析等工藝去除。因此，利用甲苯破壁法分離純化葡萄酒泥酵母SOD簡單易行，較為廉價，可為葡萄酒泥酵母開發(fā)生產(chǎn)SOD提供技術(shù)支持。

［1］林慶斌，廖升榮，熊亞紅，等.超氧化物歧化酶(SOD)的研究和應(yīng)用進展［J］.化學(xué)世界，2006，4(6):378－379.

［2］李東旭，吳蕾.超氧化物歧化酶的提取和純化技術(shù)研究進展［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29(3):183－184.

［3］李海，饒麗娟.超氧化歧化酶的研究現(xiàn)狀［J］.塔里木農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，1998，2(6):10－11.

［4］FRIDOVICH.Superoxide radical and superoxide dismutases［J］.Annu Rev Biochem，1995，64(5):97－112.

［5］張彩瑩.不同來源的超氧化物歧化酶的部分理化性質(zhì)比較研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(15):4426－4429.

［6］李宏，單振秀.利用幾種原料提取SOD的比較研究［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(3):93－94.

［7］SABARINATH SUNDARAM，SUNILKHANNA，RENU KHANNA－CHOPRA.Purification and characterization of thermostable monomeric chloroplastic Cu/Zn superoxide dismutase from Chenopodium murale［J］.Physiol.Mol.Biol.Plants，2009，15(3):199－203.

［8］ AMITRREDDI，LARANTJENSEN，AMORNRAT NARANUNTARAT，et al.The overlapping roles of manganese and Cu/Zn SOD in oxidative stress protection［J］.Free Radical Biology ＆ Medicine，2009，46(3):154－162.

［9］鄭鶴齡，張斌，潘潔，等.葡萄酒泥農(nóng)業(yè)應(yīng)用效果研究［J］.天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，12(3):47－48.

［10］劉軍，李進，曲健，等.葡萄皮渣的綜合利用［J］.中外葡萄與葡萄酒，2012，18(3):51－53.

［11］ JAROMIRLACHMAN，MILOSLAVSULC，MAREK SCHILLA.Comparison of the total antioxidant status of Bohemian wines during the wine－making process［J］.Food Chemistry，2007，10(3):802－807.

［12］蘇昕，閻浩林，梁麗.酵母SOD分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)的研究［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2005，22(1):67－68.

［13］廖湘萍，徐功瑾，付三喬.利用啤酒酵母生產(chǎn)SOD的提取條件研究［J］.釀酒科技，2007，27(5):89－91.

［14］王歲樓，張平之，張鑫，等.從活性干酵母中直接提取SOD 的研究［J］.鄭州糧食學(xué)院學(xué)報，2000，21(2):66－68.

［15］劉曉艷，丘泰球，黃卓烈.不同方法對酵母細胞膜通透性的影響［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，25(1):74－76.

［16］ TRAYANA NEDEVA，PAVLINA DOLASHKA －ANGELOVA，VESELA MOSHTANSKA，et al.Purification and partial characterization of Cu/Zn superoxide dismutase from Kluyveromyces marxianusyeast［J］.Journal of Chromatography B，2009，87(7):3529－3536.