水通道蛋白4基因敲除對(duì)老年小鼠行為和腦形態(tài)變化的影響

蘇圣桉，盧韻碧，張緯萍

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，浙江杭州 310058）

人口老齡化是21世紀(jì)人類面臨的巨大難題，我國(guó)現(xiàn)有老齡人口已超1.6億，并以每年800萬(wàn)的速度增長(zhǎng)。隨著我國(guó)逐步進(jìn)入老年型人口社會(huì)，衰老帶來(lái)的社會(huì)問(wèn)題日益突出。腦老化是衰老過(guò)程中的關(guān)鍵問(wèn)題之一，可以表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶功能下降，行動(dòng)遲緩，認(rèn)知功能減退［1］。研究影響腦老化過(guò)程的因子，有助于了解腦老化的分子機(jī)制，進(jìn)而可能找到干預(yù)腦老化過(guò)程的策略和方法。影響腦老化的分子很多，水通道蛋白4(aquaporin-4，AQP4)很可能是新的參與腦老化進(jìn)程的調(diào)節(jié)因子。

AQP4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)水的膜蛋白，廣泛分布于腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞等處。AQP4具有維持腦內(nèi)水平衡、調(diào)節(jié)滲透壓、誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞遷移等方面的作用［2-3］。而近年研究提示，AQP4可能參與腦高級(jí)功能，主要包括:①參與神經(jīng)元信號(hào)傳遞，如AQP4基因敲除小鼠表現(xiàn)出明顯的癲癇閾值升高［4］，細(xì)胞外 K+動(dòng)力學(xué)改變［3］，胞外間隙(ECS)容積變化［5］，提示 AQP4 可能影響神經(jīng)元興奮性;②AQP4主要表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞足突［6］，對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能有重要作用，而星形膠質(zhì)細(xì)胞在學(xué)習(xí)記憶等功能中的作用已逐漸被揭示。研究發(fā)現(xiàn)，AQP4參與調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)谷氨酸、谷氨酰胺等神經(jīng)遞質(zhì)的攝取［7-8］，可影響膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元的“對(duì)話”，而這一互動(dòng)交流被認(rèn)為是認(rèn)知過(guò)程所必需的［9］;AQP4在小鼠海馬發(fā)育過(guò)程中有階段性的表達(dá)上調(diào)［10］，提示其可能參與神經(jīng)發(fā)生;AQP4能強(qiáng)化小鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中的記憶鞏固過(guò)程［11］，增強(qiáng)空間記憶［12］。

有鑒于此，AQP4有可能是腦老化的調(diào)節(jié)因子之一，本研究通過(guò)比較年輕和老年AQP4+/+和AQP4-/-小鼠，觀察其活動(dòng)量、探究行為的差異，以及皮層、海馬神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)變化，分析AQP4基因敲除對(duì)小鼠腦老化過(guò)程中發(fā)生的腦形態(tài)和神經(jīng)行為變化的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及處理 所有小鼠均為CD-1品系。按基因型與月齡分為4組:年輕(2～3個(gè)月)AQP4-/-組(n=15)、老年(17～19個(gè)月)AQP4-/-組(n=15)、年輕 AQP4+/+組(n=16)和老年 AQP4+/+組(n=12)，雌雄各半。AQP4-/-小鼠由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院胡剛教授贈(zèng)送，在浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖。

1.2 行為學(xué)檢測(cè)和計(jì)算 采用大小鼠通用型自發(fā)活動(dòng)觀察系統(tǒng)(JLBehv-LAG-4，上海吉量軟件科技有限公司)觀察小鼠自發(fā)活動(dòng)。該系統(tǒng)由4個(gè)觀察箱和實(shí)時(shí)觀察記錄系統(tǒng)組成，每個(gè)觀察箱的內(nèi)徑為40 cm×40 cm×60 cm，可同時(shí)觀察4只小鼠的活動(dòng)。所有實(shí)驗(yàn)均在上午10時(shí)到下午5時(shí)之間進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)前3 d，實(shí)驗(yàn)人員每天將小鼠放在手上10 min，以消除抓握對(duì)小鼠造成的恐懼感。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天將4只小鼠(每組各1只)以頭朝前的位置放入觀察箱中央，關(guān)箱門后，在安靜環(huán)境下連續(xù)記錄小鼠活動(dòng)軌跡1 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用酒精擦洗清除異味。分析時(shí)將每個(gè)開場(chǎng)劃分為中央?yún)^(qū)域(觀察箱中央20 cm×20 cm的區(qū)域)和周邊區(qū)域。以自發(fā)活動(dòng)總路程、中央路程占總路程的比值以及中央?yún)^(qū)域滯留時(shí)間占總時(shí)間的比值作為指標(biāo)，評(píng)價(jià)小鼠活動(dòng)量及對(duì)中央?yún)^(qū)域的探究活動(dòng)。

1.3 腦切片 行為學(xué)觀察結(jié)束后，小鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，經(jīng)心臟順序灌流生理鹽水和4%多聚甲醛，取腦置入4%多聚甲醛后固定24 h，以30%蔗糖脫水7 d至腦組織沉入底部，行冰凍切片(Leica CM1900)，片厚30 μm。

1.4 甲苯胺藍(lán)染色及皮層、海馬神經(jīng)元計(jì)數(shù)

將腦片置于1%甲苯胺藍(lán)溶液染色2 min，自來(lái)水沖洗后，用0.5%鹽酸/75%乙醇溶液分化，95%乙醇及無(wú)水乙醇各脫水1次，二甲苯透明3次，以1∶1中性樹膠∶二甲苯封片。在400倍普通顯微鏡下觀察并計(jì)算5個(gè)不同視野下的海馬CA1區(qū)厚度，計(jì)數(shù)對(duì)應(yīng)的皮層Ⅲ-Ⅳ層神經(jīng)元密度。

1.5 DAB免疫組織化學(xué)染色及海馬CA3區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù) 一抗分別采用鼠抗GFAP(1∶1000)及兔抗Iba1(1∶600)單克隆抗體;二抗為生物素化羊抗兔或羊抗鼠 IgG，即用型SABC試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，按說(shuō)明書順序進(jìn)行一抗孵育過(guò)夜(4℃)、二抗和三抗分別室溫孵育2 h，然后采用DAB進(jìn)行顯色。鼠抗GFAP抗體購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司，兔抗Iba1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。在400倍普通顯微鏡下觀察5個(gè)不同視野下的海馬CA3區(qū)及對(duì)應(yīng)皮層的細(xì)胞形態(tài)，計(jì)數(shù)星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞密度。

1.6 免疫熒光染色及海馬CA3區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞面積計(jì)算 一抗分別采用鼠抗GFAP(1∶1000)及兔抗 Iba1(1∶600)單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜;二抗分別采用FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(1∶200)或FITC標(biāo)記的驢抗兔 IgG抗體(1∶200)，室溫孵育2 h后以PBS漂洗3次，將腦片貼至玻片上后室溫涼干，然后以DAPI預(yù)染的封片劑(Invitrogen)封片。所用二抗均購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司。在400倍熒光顯微鏡下觀察5個(gè)不同視野下的海馬CA3區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，根據(jù)不同灰度及像素值，采用Photoshop CS3與Image J軟件計(jì)算細(xì)胞面積占圖片總面積的比值［13-14］。

2 結(jié)果

2.1 AQP4基因敲除對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響在開場(chǎng)試驗(yàn)中年輕和老年小鼠在周邊區(qū)活動(dòng)較多(圖1A)，與年輕小鼠比，老年AQP4+/+小鼠的總活動(dòng)路程減少41.2%［(283±76)m vs(167±64)m，P ＜0.05］，老年 AQP4-/-小鼠減少44.1%［(242±56)m vs(136±99)m，P ＜0.05］(圖 1B)，但 AQP4-/-和 AQP4+/+小鼠在年輕小鼠和老年小鼠之間均無(wú)顯著差異。年輕小鼠和老年小鼠在中心區(qū)域的滯留時(shí)間占總時(shí)間的比例，以及在中心區(qū)域的活動(dòng)路程占總路程的比例均無(wú)顯著差異，AQP4-/-和AQP4+/+小鼠之間亦無(wú)顯著差異(圖1C、D)。

圖1 AQP4基因敲除對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響Fig.1 The effect of AQP4 knockout on locomotor activity of mice in open field

2.2 AQP4基因敲除對(duì)小鼠神經(jīng)元數(shù)量的影響 甲苯胺藍(lán)染色顯示:與年輕小鼠比，老年AQP4+/+小鼠皮層(Ⅲ-Ⅳ層)神經(jīng)元密度降低19.6% ［(76.1 ± 14.4)× 106/mm2vs(58.9 ±11.9)×106/mm2，P ＜0.05］，老年 AQP4-/-小鼠降低 15.8% ［(66.0 ± 10.2)× 106/mm2vs(55.6 ± 8.8)× 106/mm2，P ＜ 0.05］(圖 2A、C)，老年和年輕小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞體層的厚度無(wú)明顯差異(圖 2B、D)，AQP4-/-和AQP4+/+小鼠之間，皮層神經(jīng)元密度和海馬CA1區(qū)厚度均無(wú)明顯差異(圖2A、B、C和D)。

2.3 AQP4基因敲除對(duì)小鼠海馬CA3區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的影響 免疫組化結(jié)果顯示:與年輕小鼠比，老年 AQP4+/+小鼠海馬CA3區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞密度增加57.7%［(4.0±0.4)×106/mm2vs(6.3 ±0.5)×106/mm2，P ＜0.001］，老年 AQP4-/-小鼠增加 64.3%［(3.9 ±0.3)×106/mm2vs(6.3 ±0.6)×106/mm2，P ＜0.001］(圖 3A、C)。免疫熒光染色顯示，老年小鼠和年輕小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞所占的面積相當(dāng)(圖3B、D)，但與 AQP4+/+小鼠比較，AQP4-/-小鼠海馬CA3區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞所占的面積明顯減小，年輕小鼠AQP4+/+小鼠和AQP4-/-小鼠比較，分別為(14.0 ± 0.8)%vs(11.5 ±1.2)%(P ＜0.01)，老年小鼠 AQP4+/+小鼠和AQP4-/-小鼠比較，分別為(12.3 ± 1.8)%vs(9.4 ±1.0)%(P ＜0.01，圖3A、B、D)。

圖2 AQP4基因敲除對(duì)小鼠皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量的影響Fig.2 The effect of AQP4 knockout on the neuron density in cortex and the thickness of CA1 region in mice brain

2.4 AQP4基因敲除對(duì)小鼠海馬CA3區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的影響 小鼠海馬CA3區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞密度各組間無(wú)明顯差異(圖4A、C)。與年輕小鼠相比，老年AQP4+/+小鼠海馬CA3區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的面積增加46.9%［(8.9±1.9)%vs(13.1 ± 2.2)%，P ＜ 0.01］，老年AQP4-/-小鼠海馬CA3區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的面積增 加 52.0% ［(8.0 ± 1.9)% vs(12.1 ±1.6)%，P ＜ 0.01］(圖 4B、D)，而 AQP4-/-和AQP4+/+小鼠比較無(wú)顯著差異(圖4B、C)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，老年小鼠在開場(chǎng)中的活動(dòng)量降低、皮層神經(jīng)元密度降低、海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量和小膠質(zhì)細(xì)胞面積增加，而AQP4基因敲除對(duì)小鼠的這些變化均無(wú)明顯影響，但在年輕和老年小鼠腦內(nèi)，AQP4基因使星形膠質(zhì)細(xì)胞面積減小。

圖3 AQP4基因敲除對(duì)小鼠海馬CA3區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的影響Fig.3 The effect of AQP4 knockout on the density and mophology of astrocyte in hippocampus CA3 in mice

AQP4對(duì)腦結(jié)構(gòu)的影響有不同的報(bào)道，Zhou 等［15］發(fā)現(xiàn)，AQP4-/-小鼠血腦屏障通透性增加，結(jié)構(gòu)變化包括血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接減少，包裹血管的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突水腫。而Saadoun等［16］發(fā)現(xiàn)，AQP4基因敲除對(duì)小鼠血腦屏障的完整性及腦形態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)影響，AQP4-/-小鼠的腦容量、腦室大小、神經(jīng)元密度、星形膠質(zhì)細(xì)胞密度等均與AQP4+/+小鼠相同。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 AQP4-/-小鼠與 AQP4+/+小鼠，皮層神經(jīng)元密度、海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞體厚度、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量均無(wú)明顯區(qū)別，與Saadoun等的報(bào)道一致。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，AQP4-/-小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體有明顯減小，這與Nicchia等［17］在體外的發(fā)現(xiàn)一致，該研究報(bào)道在原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4敲低可以通過(guò)影響細(xì)胞骨架使星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)減少，細(xì)胞面積減小。AQP4基因敲除僅影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的原因，可能與AQP4在腦內(nèi)主要表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)［6，18］。

圖4 AQP4基因敲除對(duì)小鼠海馬CA3區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的影響Fig.4 The effect of AQP4 knockout on the density and mophology of microglia in hippocampus CA3 in mice

AQP4對(duì)腦功能影響的研究多集中在AQP4對(duì)腦損傷的影響方面，如AQP4基因敲除可以減輕腦冷凍傷引起的急性期損傷，減輕后期的星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)，但可以加重腦冷凍傷引起的慢性期損傷，并加重后期的小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)［19］;AQP4對(duì)學(xué)習(xí)記憶等神經(jīng)功能影響的研究相對(duì)較少，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AQP4在腦內(nèi)除了保持水和離子平衡外，還參與星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)甘露醇［20］、谷氨酸、谷氨酰胺［8］等一系列因子的攝取和調(diào)節(jié)，從而可能影響神經(jīng)元突觸興奮性，影響神經(jīng)功能。2011年，Skuca等［12］研究了AQP4基因敲除對(duì)小鼠與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)和長(zhǎng)時(shí)程抑制(LTD)的影響，發(fā)現(xiàn)AQP4基因敲除僅影響與神經(jīng)生長(zhǎng)因子BDNF相關(guān)的LTP及LTD，并影響了相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶功能，故提出AQP4對(duì)神經(jīng)功能的影響是選擇性的。本研究發(fā)現(xiàn)，AQP4基因敲除并不影響小鼠在開場(chǎng)試驗(yàn)中的活動(dòng)量，以及對(duì)中心區(qū)域的探究活動(dòng)，這可能與選擇的行為學(xué)檢測(cè)模型有關(guān)。

在老年過(guò)程中，隨著腦老化的進(jìn)展，神經(jīng)元出現(xiàn)退行性變，神經(jīng)元密度逐漸降低［21］，反之，膠質(zhì)細(xì)胞開始激活，可表現(xiàn)為膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的增加和形態(tài)增大等變化，伴活性物質(zhì)的釋放［22-24］;同時(shí)，一些神經(jīng)行為，如活動(dòng)量也隨之降低［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，老年小鼠在開場(chǎng)中的活動(dòng)量降低，老年小鼠皮層神經(jīng)元密度降低。老年小鼠CA3區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞密度增加，而面積未發(fā)生變化，而小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量未見明顯變化，面積增加。在腦老化過(guò)程的這些變化中，AQP4-/-小鼠與AQP4+/+小鼠的變化趨勢(shì)完全相同，兩種小鼠之間的差異主要表現(xiàn)在星形膠質(zhì)細(xì)胞面積，年輕和老年AQP4-/-小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體面積仍明顯小于相應(yīng)的AQP4+/+小鼠。已有文獻(xiàn)報(bào)道，與年輕小鼠相比，AQP4在老年小鼠有顯著上調(diào)［26］。由于在腦老化過(guò)程中，細(xì)胞外間隙(extracellular space，ECS)容積逐漸減?。?7-28］，可能導(dǎo)致細(xì)胞電活動(dòng)的紊亂及滲透壓的失衡。而老年鼠腦中AQP4上調(diào)可能是機(jī)體拮抗ECS容積縮小，以適應(yīng)由神經(jīng)元活動(dòng)產(chǎn)生的ECS滲透壓及離子動(dòng)力學(xué)變化的一種保護(hù)機(jī)制［26］。因此，AQP4參與的腦老化過(guò)程可能是更為精細(xì)的調(diào)控過(guò)程，在離子變化，或者神經(jīng)遞質(zhì)等物質(zhì)的變化方面，可能需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，AQP4對(duì)小鼠老年過(guò)程中的神經(jīng)元、小膠質(zhì)及活動(dòng)量變化無(wú)直接影響，但由于腦老化過(guò)程中有明顯的星形膠質(zhì)細(xì)胞激活，而AQP4基因敲除可減小星形膠質(zhì)面積，故AQP4可能通過(guò)影響星形膠質(zhì)細(xì)胞功能，參與相關(guān)的神經(jīng)功能變化。

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