微孔板結合化學發(fā)光法快速測定覆盆子中總糖蛋白的抗氧化活性

雷利芳，游 靜，曾華金，楊 冉*，屈凌波，3*

(1.鄭州大學化學與分子工程學院，河南鄭州 450001;2.鄭州大學藥學院，河南鄭州 450001;3.河南工業(yè)大學化學化工學院，河南鄭州 450001)

1 引 言

糖蛋白(glycoprotein)是生物細胞的重要組成部分，是一類由比較短且通常具有分支的寡糖與多肽鏈某些特殊部位的羥基或酰氨基共價連接而成的結合蛋白質。隨著國內外科學工作者對糖蛋白性質、結構、功能認識的不斷深入，發(fā)現植物糖蛋白除了具有凝集素、結構蛋白、酶、貯藏蛋白和毒素等方面的作用外，還具有多種保健功能，如抗糖尿?。?］、降血脂［2］、抗氧化［3-4］、免疫調節(jié)［5］、抗腫瘤［6］等。因此，植物糖蛋白在新型特種藥物及功能性保健品開發(fā)方面具有廣闊的應用前景，是繼多糖之后天然活性成分研究的又一熱點。

覆盆子是薔薇科懸鉤子屬植物華東覆盆子(Rubus chingii Hu.)的近成熟干燥果實，始載于《名醫(yī)別錄》，具有“益腎、固精、縮尿”之功效。通過家蠅壽命實驗，對100個抗衰延壽古方進行篩選研究表明，覆盆子為作用最為顯著的7味中藥之一，因而覆盆子具有較強的延緩衰老的作用［7］?，F代藥理學研究表明，覆盆子中所含的糖蛋白具有明顯清除O2－、·OH和H2O2等自由基的成分，可能是覆盆子延緩衰老的物質基礎之一［8］。然而，這些測定清除自由基的方法往往采用傳統(tǒng)的比色法，方法樣品用量大，操作繁雜費時，不利于樣品的快速檢測及高通量篩選。因此，建立一種微量、簡單可靠的測定覆盆子糖蛋白抗氧化的方法，對于研究覆盆子延緩衰老的物質基礎及其作用機理具有非常重要的意義。

本文將微孔板與化學發(fā)光法結合，利用魯米諾-過氫化氫(luminol-H2O2)、魯米諾-鄰苯三酚-氫氧化鈉(luminol-pyrogallol-NaOH)和魯米諾-硫酸銅-過氧化氫(luminol-CuSO4-H2O2)化學發(fā)光體系，對不同地方市售覆盆子中的總糖蛋白進行抗氧化活性研究，為覆盆子抗衰老機理提供了實驗基礎。

2 實 驗

2.1 主要儀器與試劑

實驗中使用的儀器主要有Centro XS3 LB 960化學發(fā)光分析儀(Berthold technologies，Germany)，可拆卸96孔聚苯乙烯板(Corning，UAS)，PHS-3C精密pH計(上海精科雷磁儀器廠)，AL-104電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)等。覆盆子購于全國各藥材店(1-浙江Ⅰ，2-浙江Ⅱ，3-廣西Ⅰ，4-廣西Ⅱ，5-福建Ⅰ，6-福建Ⅱ，7-江蘇，8-廣東，9-吉林，10-遼寧，11-河南，12-四川)。

魯米諾儲備液(10 mmol·L－1)的配制:準確稱取0.177 2 g 魯米諾(Sigma，USA)，用0.1 mol·L－1的NaOH溶液溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，避光保存，放置3 d后使用，使用時用水稀釋至所需濃度。

鄰苯三酚儲備液(0.01 mol·L－1):準確稱取0.012 6 g鄰苯三酚，超純水定容至10 mL，使用時用水稀釋至所需濃度。其它所用試劑均為分析純，水為超純水。

2.2 覆盆子總糖蛋白的提取［9］

稱取覆盆子粉末7.0 g，加入100 mL蒸餾水，常溫下于超聲波提取50 min，然后在4 000 r/min的轉速下離心10 min，取上清液，沉淀物再提取1次。合并兩次的上清液，按5∶1的體積比加入Sevag試劑 V(氯仿)∶V(正丁醇)=5∶1)，劇烈振蕩20 min后，在4 000 r/min的轉速下離心10 min，去除游離的雜蛋白，重復3次;然后加入4倍體積的無水乙醇，于4℃下過夜，次日在4 000 r/min的轉速下離心20 min取沉淀;將沉淀用少量水溶解后裝入透析袋中，于4℃下用蒸餾水透析3 d，然后冷凍干燥備用。

2.3 實驗方法

化學發(fā)光分析流程圖如圖1所示。將100 μL樣品溶液加入微孔板中，然后由通道a通入氧化劑(過氧化氫溶液、鄰苯三酚溶液等)，迅速振蕩混均后再由通道b通入魯米諾溶液，迅速振蕩混均后記錄反應10 s內的發(fā)光信號。將其中未加入樣品的體系所產生的化學發(fā)光強度定義為本體發(fā)光值I0，而將樣品加入到發(fā)光體系中所得到的化學發(fā)光強度定義為I，則降低的化學發(fā)光值ΔI=I0－I，以ΔI作為定量分析的依據。

圖1 化學發(fā)光儀流程圖。a:氧化劑溶液;b:魯米諾溶液。Fig.1 Schematic diagram of the chemiluminescence system.a:oxidizing solution.b:luminol solution.

3 結果與討論

3.1 覆盆子糖蛋白的提取

按2.2節(jié)方法進行覆盆子中總糖蛋白的提取，結果如表1所示。覆盆子中總糖蛋白的含量基本上保持一個水平，但可能由于覆盆子各產地的氣候條件、采收時間、貯藏條件及貯藏時間的不同而略顯差異。覆盆子總糖蛋白的平均提取量為(0.13 ±0.03)g，平均提取率為1.90% ±0.48%。

表1 覆盆子總糖蛋白提取結果Table 1 The extraction results of total glycoprotein from Rubus chingii Hu.

3.2 化學發(fā)光動力學曲線

實驗用Centro XS3 LB 960化學發(fā)光分析儀系統(tǒng)研究了化學發(fā)光反應動力學性質。在堿性條件下，糖蛋白對魯米諾-過氫化氫、魯米諾-鄰苯三酚-氫氧化鈉和魯米諾-硫酸銅-過氧化氫化學發(fā)光體系具有顯著的抑制作用(圖2)?；谶@一特點，可以利用這些化學發(fā)光體系測定糖蛋白清除H2O2、O2－和·OH的能力。由圖2可見，空白體系的發(fā)光動力學曲線與樣品體系的發(fā)光動力學曲線基本一致，但發(fā)光強度卻發(fā)生了明顯的變化，表明糖蛋白對這3個化學發(fā)光體系的發(fā)光強度有明顯的抑制作用。在魯米諾-過氫化氫和魯米諾-硫酸銅-過氧化氫化學發(fā)光體系中，化學發(fā)光的差值(ΔI)達到最大值分別在進樣后的8 s和5 s;而在魯米諾-鄰苯三酚-氫氧化鈉化學發(fā)光體系中，加樣后立即達到最大值。因此，分別選擇加樣后8，5，0 s的 ΔI值計算樣品清除 H2O2、O2－和·OH 能力。若按每一樣品記錄測定時間為10 s計算，那么每小時能測定的樣品個數大約為360，這為大批樣品的高通量篩選節(jié)約了大量的時間，也為抗氧化測定提供了簡便有效的方法。

圖2 化學發(fā)光動力學曲線。(a)魯米諾-過氫化氫體系。a:40 μmol·L－1魯米諾溶液加入0.48%過氧化氫溶液;b:a加入 4.4 μg·L－1糖蛋白溶液;c:a 加入 9.8 μg·L－1糖蛋白溶液。(b)魯米諾-鄰苯三酚-氫氧化鈉體系。a:0.1 mmol·L－1魯米諾溶液加入0.25 mmol·L－1鄰苯三酚溶液加入6.0 mmol·L－1氫氧化鈉溶液;，b:a 加入 0.04 μg·L－1糖蛋白溶液;c:a 加入0.22 μg·L－1糖蛋白溶液。(c)魯米諾-硫酸銅-過氧化氫體系。a:5.0 mmol·L－1魯米諾溶液加入 0.07 μmol·L－1硫酸銅溶液加入 0.24%過氧化氫溶液;b:a 加入 4.4 μg·L－1糖蛋白溶液;c:a 加入14.8 μg·L－1糖蛋白溶液。Fig.2 Chemiluminscence signal.(a)luminol-H2O2system.a:40 μmol·L－1luminol+0.48%H2O2.b:a+4.4 μg·L －1 glycoprotein.c:a+9.8 μg·L －1glycoprotein.(b)luminol-pyrogallol-NaOH system.a:0.1 μmol L－1luminol+2.5 ×10 －4mol·L －1pyrogallol+6.0 ×10 －3mol·L －1NaOH.b:a+0.04 μg·L－1glycoprotein.c:a+0.22 μg·L－1glycoprotein.(c)luminol-CuSO4-H2O2system.a:5.0 μmol·L －1luminol+0.07 μmol·L －1CuSO4+0.24%H2O2.b:a+4.4 μg·L －1glycoprotein.c:a+14.8 μg·L －1glycoprotein.

3.2 實驗條件的優(yōu)化

為了獲得最佳的檢測靈敏度和最適合的聲噪比，對各個發(fā)光體系中的溶液濃度進行了考察，結果如表1所示。從表中可以看出在魯米諾-過氧化氫體系中，當魯米諾濃度為 40 μmol·L－1，過氧化氫濃度為0.48%，且pH值為9.2時，樣品清除H2O2的能力最強;在魯米諾-鄰苯三酚-氫氧化鈉體系中，當魯米諾濃度為 0.1 mmol·L－1，鄰苯三酚濃度為 0.25 mmol·L－1和 NaOH 濃度為 6.0 mmol·L－1時，樣品清除 O2－的能力最強;而在魯米諾-硫酸銅-過氧化氫體系中，當魯米諾濃度為5.0 μmol·L－1，CuSO4濃度為 0.07 μmol·L－1和H2O2濃度為0.24%時，樣品清除·OH的能力最強。

表2 測定糖蛋白的最佳條件Table 2 The optimum conditions for determination of glycoprotein

3.3 線性范圍、精密度及檢出限

在上述優(yōu)化條件下，利用各化學發(fā)光體系對不同市售覆盆子中糖蛋白進行了測定，結果見表2。在上述3種化學發(fā)光體系中，發(fā)光強度ΔI均與一定濃度范圍內的糖蛋白呈線性關系。對濃度為50 μg·L－1的糖蛋白溶液分別用魯米諾-過氫化氫、魯米諾-鄰苯三酚-氫氧化鈉和魯米諾-硫酸銅-過氧化氫體系平行測定6次，得到3種化學發(fā)光體系的板內及板間標準偏差分別為2.08%、1.77%、2.13%和 5.78%、3.23%、3.64%。

表3 覆盆子糖蛋白的回歸方程、線性范圍、檢出限及IC50值Table 3 Linear regression equations，linear ranges，detection limit and IC50of glycoprotein of Rubus chingii Hu.

續(xù)表3

3.4 糖蛋白清除自由基能力相關性分析

將上述所獲得的IC50值，采用 Spearman等級相關系數法(SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，USA)對覆盆子中糖蛋白清除H2O2、O2－和·OH能力進行相關性分析(表3)。結果表明，在置信度為0.95時，覆盆子總糖蛋白清除H2O2和·OH的能力顯著相關(r=0.643，p=0.024)，而清除H2O2和·OH的能力與清除O2－的能力卻沒有明顯的相關性(r= － 0.042，p=0.897;r=0.273，p=0.391)，這一結果與其反應動力學曲線相對應。在清除H2O2和·OH自由基時，化學發(fā)光類型表現為輝光型，而在清除O2－自由基時卻表現為閃光型。然而，由于糖蛋白結構比較復雜，即使通過純化分離得到分子量相對單一的糖蛋白，也會由于蛋白質所連接糖的差異而有所不同，因而對糖蛋白抑制化學發(fā)光的機理研究還需進一步探索。

表4 覆盆子糖蛋白清除自由基相關性結果Table 4 The correlation results of scavenging free radical of glycoprotein of Rubus chingii Hu.

4 結 論

將微孔板與化學發(fā)光法相結合，建立了一種快速測定覆盆子中總糖蛋白清除自由基活性的方法。與傳統(tǒng)的比色法相比，該方法具有樣品用量少、操作簡單、檢則速度快等優(yōu)點，適用于中藥中有效成分的抗氧化活性檢測及藥物活性的大批量篩選。

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