尋常性銀屑病患者外周血Th17/Treg平衡偏移的研究

陳晉廣 ，賴維 ，姜昱

（1.廣東省中山市人民醫(yī)院，中山528403；2.浙江省臺(tái)州市立醫(yī)院，臺(tái)州318000；3.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣州510630）

銀屑病是一種治療困難、危害大、復(fù)發(fā)率高的頑固性皮膚病。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，天然免疫而不是獲得性免疫在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中起到更為重要的作用，天然免疫是機(jī)體免疫防御的首要防線,可能比特異性免疫紊亂對(duì)銀屑病的發(fā)病具有更關(guān)鍵的作用。目前調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell,Treg）在天然免疫紊亂中的作用成為研究的一大熱點(diǎn)。介導(dǎo)免疫耐受的Treg和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的Th17細(xì)胞均來源于初始T淋巴細(xì)胞，兩者的分化過程和功能相互拮抗維持動(dòng)態(tài)的平衡,從而維持機(jī)體的免疫穩(wěn)定。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，輔助性T細(xì)胞17（T helper 17 Cells,Th17）相關(guān)細(xì)胞因子人白細(xì)胞介素-17（human interleukin-17）、IL-23在銀屑病患者外周血中表達(dá)明顯高于正常人群，提示Th17功能失常參與了銀屑病發(fā)病過程[1]；本研究基于前期研究，對(duì)患者外周血Th17、Treg細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，探討Th17/Treg的平衡偏移以及在其發(fā)病中的作用，結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 病例資料 46例尋常性銀屑病患者來自2012年1月—2012年10月本院皮膚科門診和住院患者。其中靜止期21例（男12例,女9例；年齡19～51歲，病程 8～10.5年），進(jìn)行期 25例（男13例，女12例；年齡18～50歲，病程8.5～11年）。銀屑病患者病情嚴(yán)重程度按照PASI[2]積分法評(píng)分并記錄。20例正常對(duì)照組來自本院門診獻(xiàn)血員（男11例，女9例；年齡18.5～48歲）。2組患者年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有研究對(duì)象對(duì)實(shí)驗(yàn)知情同意，實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 患者近半個(gè)月內(nèi)接受過免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素及光療等相關(guān)治療；伴有心腦血管、肝、腎等疾病及免疫性疾病和內(nèi)分泌等系統(tǒng)性疾病的患者。

1.3 Th17細(xì)胞和CD4+CD25+Treg細(xì)胞亞群檢測(cè)所有研究對(duì)象于清晨空腹抽取外周靜脈血5 mL，肝素進(jìn)行抗凝，采用淋巴細(xì)胞分離液以聚蔗糖（ficoll）密度梯度法分離出外周血淋巴細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS；含 1%小牛血清）沖洗,制備淋巴細(xì)胞懸液（濃度1×109/L）。取淋巴細(xì)胞懸液置于 48孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔 1 mL,加 50 μg/L佛波酯、1 mg/L離子霉素和莫能菌素2 μmol/L,孵箱（德國 HERAEUS公司，37℃、5%CO2） 中培養(yǎng) 5 h。收集細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)管和對(duì)照管，加入20 μL PE-Cy5標(biāo)記的鼠抗人CD4單抗 （美國e Bioscience公司）混勻,放置20 min（室溫、避光），對(duì)細(xì)胞表面抗原進(jìn)行染色。加200 μL Cytofix/Cytoperm液,在4℃下放置20 min，通透和固定細(xì)胞，洗滌。實(shí)驗(yàn)管分別加入10 μL FITC標(biāo)記的鼠抗人 CD25抗體（美國 e Bioscience公司）、FITC標(biāo)記的IL-17抗體（美國e Bioscience公司），對(duì)照管加入同型對(duì)照抗體,孵育30 min后（4℃、避光）,用 Perm/Wash液1 mL洗滌 2次，以300 μL洗滌液重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀（EPICS-XL COULTER）于24 h內(nèi)檢測(cè)分析。以CD4直方圖設(shè)門區(qū)分Th細(xì)胞（CD4＋），最終以散點(diǎn)圖IL-17、CD25染色陽性分別表示 Th17細(xì)胞和 Treg細(xì)胞，數(shù)據(jù)用Cellsquest軟件分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析。Th17與Treg細(xì)胞數(shù)量比較用Mann-Whitney檢驗(yàn)；用Spearman建立Th17/Treg與PASI之間的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銀屑病患者Th17/Treg表達(dá)與對(duì)照組的比較進(jìn)行期、靜止期銀屑病患者外周血中Th17細(xì)胞表達(dá)均明顯高于對(duì)照組（P<0.05），進(jìn)行期表達(dá)水平高于靜止期患者（P<0.05）；2組患者Treg細(xì)胞表達(dá)與正常組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。進(jìn)行期Th17/Treg明顯高于對(duì)照組和靜止期（P<0.05），靜止期患者 Th17/Treg高于對(duì)照組（P＜0.05）。見表1。

2.2 Th17、Treg表達(dá)患者PASI相關(guān)性分析 銀屑病患者外周血中Th17的表達(dá)與PASI呈正相關(guān)（rs＝0.421，P＜0.05）；Th17/Treg 與 PASI 呈正相關(guān)（rs＝0.502，P＜0.05）；Treg 與 PASI無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

表1 銀屑病患者Th17、Treg表達(dá)與對(duì)照組的比較

3 討論

在不同的條件和抗原刺激的信號(hào)中，初始CD4+T淋巴細(xì)胞可分化成多種亞型的T淋巴細(xì)胞，包括Th1/Th2型、Th17/Treg型，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[3]。其中，Th17/Treg細(xì)胞是近年來發(fā)現(xiàn)的CD4+T新亞型，具有與Th1/Th2不同的獨(dú)立分化途徑，成為目前免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。Th17細(xì)胞在中性粒細(xì)胞的動(dòng)員、募集、活化和介導(dǎo)促炎反應(yīng)中起到重要的作用；Treg細(xì)胞在功能上和分化過程中與Th17細(xì)胞相互對(duì)抗，對(duì)機(jī)體自身反應(yīng)性T細(xì)胞以及一些效應(yīng)性T細(xì)胞活化具有選擇性抑制效應(yīng)；正常生理狀態(tài)下兩者保持動(dòng)態(tài)平衡。近年來隨著對(duì)Th17、Treg細(xì)胞研究的深入，使人們對(duì)許多自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)。越來越多證據(jù)表明，兩者在多種自身免疫性疾病、炎性疾病、腫瘤和感染性疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。在銀屑病小鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Treg細(xì)胞功能受損及IL-23/Th17途徑細(xì)胞因子水平增高[4]，提示Th17/Treg參與了銀屑病的發(fā)病過程。

本研究顯示，Th17細(xì)胞在銀屑病患者外周血中表達(dá)水平明顯升高。Chan等[5]在小鼠皮內(nèi)分別注射IL-23、Th1分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子IL-12，經(jīng)注射IL-23后誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥性病理表現(xiàn)與銀屑病皮損更為接近，研究認(rèn)為Th17細(xì)胞可能是產(chǎn)生銀屑病皮損病變的主要啟動(dòng)者。筆者本次研究還發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者外周血中Treg細(xì)胞與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此推測(cè)，Th17細(xì)胞呈表達(dá)狀態(tài)，而患者Treg不能伴隨Th17細(xì)胞升高而上升，勢(shì)必導(dǎo)致患者Th17/Treg比值的升高。Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者皮損處Th17/Treg比例與PASI積分呈負(fù)相關(guān)，而循環(huán)中Th17/Treg的比例與PASI分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)。筆者本次研究顯示，銀屑病患者外周血中Th17的表達(dá)與 PASI呈正相關(guān)，Th17/Treg與PASI呈正相關(guān)，與Zhang等[6]報(bào)道一致。提示，銀屑病Th17/Treg變化水平可能為今后臨床評(píng)估患者病情提供又一客觀指標(biāo)。近年來隨著Th17/Treg研究深入，開展了許多針對(duì)性治療的實(shí)驗(yàn)研究?？鼓[瘤壞死因子拮抗劑依那西普能夠逆轉(zhuǎn)Th1/Th17細(xì)胞的活化，從而上調(diào)Th2、Treg亞群，達(dá)到治療銀屑病的目的[7]；臨床研究發(fā)現(xiàn)，糾正銀屑病患者Th17/Treg的失衡有望成為新的藥物治療靶點(diǎn)[8]。因此，通過Th17/Treg失衡的研究不僅解釋或完善銀屑病部分發(fā)病機(jī)制，而且可能在臨床上為銀屑病臨床治療提供新方向。

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[8]陳晉廣，賴維，姜昱.“血分論治”對(duì)尋常型銀屑病患者Th17/Treg影響的研究[J].中國醫(yī)師雜志,2012,14（8）:1027-1028.