牛膝干預(yù)腎虛血瘀型多囊卵巢綜合征的成分靶點(diǎn)和通路分析

袁仁智 唐鵬 雍志強(qiáng)

摘要 目的：運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和技術(shù)研究牛膝治療多囊卵巢綜合征（PCOS）的主要活性成分、靶點(diǎn)、通路等藥理學(xué)作用機(jī)制。方法：通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）篩選出牛膝的活性成分和潛在靶點(diǎn);查詢NCBI數(shù)據(jù)庫獲得PCOS疾病靶點(diǎn)，找到藥物和疾病的共靶點(diǎn);通過DAVID數(shù)據(jù)庫對共靶點(diǎn)進(jìn)行基因功能GO富集分析和KEGG富集分析;采用Cytoscape軟件構(gòu)建成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果：篩選得到有靶點(diǎn)的牛膝候選活性化合物共24個(gè)，作用于128個(gè)靶點(diǎn);與PCOS的22個(gè)共靶點(diǎn)主要涉及AGE-RAGE信號通路、核因子-κB信號通路、TNF信號通路等;共靶點(diǎn)涉及化合物23個(gè)，7個(gè)靶點(diǎn)涉及5個(gè)及以上化合物，ESR1和AR涉及化合物多達(dá)19個(gè)，還有GSK3B（12個(gè)）、ESR2（11個(gè)）、PPARG（11個(gè)）、ADRB2（9個(gè)）涉及較多化合物。結(jié)論：牛膝治療PCOS具有多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)，通過干預(yù)分子網(wǎng)絡(luò)、生物過程和信號通路來發(fā)揮抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂、促進(jìn)微循環(huán)及改善胰島素抵抗的作用。

關(guān)鍵詞 牛膝;多囊卵巢綜合征;腎虛血瘀;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);成分;靶點(diǎn);通路;富集分析

Abstract Objective：To study the pharmacological mechanism of Achyranthes bidentata in the treatment of polycystic ovary syndrome（PCOS）by network pharmacological methods and techniques.Methods：The active components and potential targets of Achyranthes bidentata were screened by the platform of systematic pharmacological analysis of traditional Chinese medicine（TCMSP）; the PCOS disease targets were obtained by querying the NCBI database to find the co-target of drugs and diseases; the gene function GO enrichment analysis and KEGG enrichment analysis were carried out by DAVID database on the co-target database; and the component-target-pathway network was constructed by Cytoscape software.Results：A total of 24 bull knee candidate active compounds were screened，and 128 targets were selected.The 22 common targets with PCOS mainly involved the AGE-RAGE signal path，NF-κB signal path，TNF signal path，etc.A total of 23 target involved in compounds，7 targets involved 5 or more compounds，ESR1 and AR involved as many as 19 compounds，as well as GSK3B（12），ESR2（11），PPARG（11），ADRB2（9）or more compounds.Conclusion：Achyranthes bidentata in the treatment PCOS has the characteristics of multi-component and multi-target synergistic effects.It can play the role of anti-inflammatory，anti-tumor，regulating blood lipid，promoting microcirculation and improving insulin resistance by interfering with molecular network，biological process and signaling pathway.

Keywords Achyranthes bidentata; PCOS; Kidney deficiency and blood stasis; Network pharmacology; Components; Targets; Pathways; Enrichment analysis

中圖分類號：R282 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.22.003

多囊卵巢綜合征（Polycystic Ovarian Syndrome，PCOS）是影響女性最常見的內(nèi)分泌紊亂疾病，在育齡女性中的發(fā)病率為5% ～20%，近年呈不斷上升趨勢。PCOS主要特征包括月經(jīng)周期紊亂、高雄激素血癥和肥胖等臨床綜合征[1]。PCOS的發(fā)病機(jī)制及其相關(guān)的癥狀雖有待解釋，但癥狀和體征上的異質(zhì)性提示其不可能是單一因素引起[2]。PCOS的發(fā)生不僅受遺傳影響，也和下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)控功能紊亂、高胰島素血癥、肥胖、精神、心理、環(huán)境等因素密切相關(guān)[3]。中醫(yī)藥辨證論治的個(gè)性化方案在治療多囊卵巢綜合征方面有其獨(dú)到之處。通過收集古今中醫(yī)名家治療多囊卵巢綜合征疾病或癥狀的方劑加以整理，運(yùn)用中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)治療PCOS證候組合中，以腎虛血瘀型和肝郁腎虛型最多，腎、脾、肝三臟功能失調(diào)是PCOS主要病機(jī)，補(bǔ)虛和解郁是治療PCOS的思路，而補(bǔ)腎健脾、疏肝解郁、理氣化痰、活血化瘀是治療PCOS的主要治法[4]。在治療PCOS的活血化瘀方劑中，牛膝的使用頻次較高，且其具有逐瘀通經(jīng)，補(bǔ)益肝腎，強(qiáng)筋壯骨，利尿通淋，引血下行的功效。故本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析牛膝的化學(xué)成分、靶點(diǎn)和通路之間的關(guān)系，試圖從整體層面揭示牛膝治療PCOS的藥理學(xué)機(jī)制。

1 資料與方法

借助中國中醫(yī)科學(xué)院研制的中醫(yī)傳承輔助平臺（2.5版本）建立多囊卵巢綜合征方劑數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘[4]，數(shù)據(jù)庫收集130位現(xiàn)代醫(yī)家的352個(gè)方劑，通過對腎虛血瘀型方劑運(yùn)用熵聚類法進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)在同時(shí)具有補(bǔ)腎和活血功效的中藥中，牛膝的使用頻次最高，故對其開展網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的相關(guān)研究，揭示其治療PCOS的藥理學(xué)機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 牛膝活性成分篩選及其潛在靶點(diǎn)預(yù)測 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）作為目前國內(nèi)較為完善的草藥成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫，共收錄了505味草藥的12 144個(gè)活性成分、關(guān)鍵藥物動(dòng)力學(xué)（ADME）性質(zhì)、類藥性、作用的靶點(diǎn)、參與的通路及相關(guān)疾病，為中草藥的性質(zhì)檢索、新藥開發(fā)和中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論的現(xiàn)代闡釋提供了新手段和新方法。進(jìn)入TCMSP平臺（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），選擇Herb name，輸入“niuxi”，獲得176個(gè)化學(xué)成分，然后根據(jù)口服生物利用度（OB）和藥物相似度（DL）進(jìn)行篩選，設(shè)為OB≥30%，DL≥0.03，去重后最后得到牛膝活性化合物30個(gè)。見表1。另外，oleanolic acid的OB值接近30%（29.02），因其為牛膝的主要成分特根據(jù)文獻(xiàn)補(bǔ)入。同時(shí)在TCMSP中獲得24個(gè)化合物的535個(gè)潛在靶點(diǎn)（其中有7個(gè)化合物無靶點(diǎn)），篩去重復(fù)項(xiàng)，經(jīng)整理得到128個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 藥物與疾病共靶點(diǎn)及化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) NCBI是一個(gè)關(guān)于分子生物學(xué)、生物化學(xué)和遺傳學(xué)知識的存儲和分析的數(shù)據(jù)庫。進(jìn)入NCBI基因數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），以“polycystic ovarian syndrome”為關(guān)鍵詞檢索，選擇種屬“人類”，得到228個(gè)PCOS疾病基因靶點(diǎn)。

將牛膝與PCOS疾病靶點(diǎn)分別錄入Excel建立文檔，通過比對找到兩者的共有靶點(diǎn)22個(gè)，涉及化合物23個(gè)，這些可能是PCOS的主要作用靶點(diǎn)。見表2。將共靶點(diǎn)及其對應(yīng)化合物數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.0構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)（CT）網(wǎng)絡(luò)。見圖1。45個(gè)節(jié)點(diǎn)代表化合物和靶點(diǎn)，111條連線代表化合物和靶點(diǎn)的關(guān)系，每個(gè)靶點(diǎn)涉及的化合物均值為4.83，每個(gè)化合物涉及的靶點(diǎn)均值為5.05，涉及4個(gè)及以上靶點(diǎn)的化合物有13個(gè)，最多的有17個(gè)靶點(diǎn)。涉及5個(gè)及以上化合物的靶點(diǎn)有7個(gè)，最多的涉及19個(gè)化合物。這13個(gè)化合物和7個(gè)靶點(diǎn)很可能與PCOS關(guān)系最為密切。

2.3 共靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 藥物作用既可以表現(xiàn)為直接的靶點(diǎn)結(jié)合和單一的信號通路，也可以是直接靶點(diǎn)和間接靶點(diǎn)共同調(diào)控等多靶點(diǎn)、多通路、多層次的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)模式。因此通過蛋白之間的相互作用關(guān)系即PPI網(wǎng)絡(luò)可以進(jìn)一步深入分析藥物對PCOS的重要影響。進(jìn)入String數(shù)據(jù)庫，點(diǎn)擊Multiple Proteins，輸入22個(gè)共靶點(diǎn)，種屬“人類”，設(shè)置評分為0.4，網(wǎng)絡(luò)邊緣含義為“molecular action（分子作用）”，得到蛋白互作特征網(wǎng)絡(luò)。見圖2。節(jié)點(diǎn)數(shù)為22，邊數(shù)為97，平均節(jié)點(diǎn)度為8.82，局部聚類系數(shù)為0.676。PPI富集P值<1.0E-16。這意味著蛋白質(zhì)之間的相互作用比基因組中隨機(jī)的一組相似大小的蛋白質(zhì)所預(yù)期的更多，即蛋白質(zhì)之間的活躍度較高。

2.4 靶點(diǎn)通路注釋分析 通過OMICSHARE（http：//www.omicshare.com/）在線工具動(dòng)態(tài)GO富集分析得到GO富集236條，設(shè)置參數(shù)為FDR<0.05，P<0.05，獲得GO條目133個(gè)。見表3，圖3。其中生物途徑（BP）前5個(gè)為細(xì)胞壞死、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞調(diào)控翻譯、細(xì)胞分化。分子功能（MF）前5個(gè)為酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合、DNA結(jié)合、核酸結(jié)合。細(xì)胞定位（CC）前5個(gè)為細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外區(qū)域部分、胞質(zhì)部分、核內(nèi)體、胞外區(qū)。通過OMICSHARE（http：//www.omicshare.com/）在線工具KEGG富集分析得到KEGG信號通路富集90條，設(shè)置參數(shù)為P<0.05，得到KEGG條目17條。見表4，圖4。同時(shí)借助Cytoscape3.7.0構(gòu)建靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。見圖5。

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（Network Pharmacology）是一門從生物網(wǎng)絡(luò)的角度研究疾病的發(fā)生和發(fā)展的過程，認(rèn)識藥物與機(jī)體的相互作用并指導(dǎo)新藥發(fā)現(xiàn)的學(xué)科。在研究工具上，該學(xué)科借助高通量組學(xué)數(shù)據(jù)、分子網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)以及計(jì)算機(jī)模擬分析，研究藥物的作用機(jī)制和促進(jìn)藥物創(chuàng)新[5]。而中醫(yī)的整體觀念、辨證論治理論與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀高度一致，因此，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究中醫(yī)方藥的作用機(jī)制成為目前藥理學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)[6]。本研究通過數(shù)據(jù)挖掘PCOS腎虛血瘀型方劑核心藥物牛膝，借助系統(tǒng)藥理學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)和生物信息學(xué)方法來確定牛膝的活性化合物及與PCOS相關(guān)的靶點(diǎn)和通路。

本研究通過TCMSP平臺的OB和DL篩選，獲得牛膝的23個(gè)化合物和128個(gè)靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其中靶點(diǎn)最多的是槲皮素（87個(gè)靶點(diǎn)）和山柰酚（55個(gè)靶點(diǎn)），其次是β-谷甾醇、豆甾醇、漢黃芩素、β-蛻皮甾酮、齊墩果酸等。有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有降低體質(zhì)量和卵巢直徑，恢復(fù)卵泡腺外層及黃體功能的作用，并證實(shí)其具有減輕多囊卵巢綜合征患者性激素和代謝紊亂的作用[7]。Neisy等[8]研究表明：槲皮素能顯著減少PCOS-IR和顯著誘導(dǎo)子宮GLUT4和ERα基因的表達(dá)?？诜a(bǔ)充槲皮素可以降低多囊卵巢綜合征超重或肥胖患者的抵抗素血漿水平和基因表達(dá)以及睪酮和LH濃度[9];Rezvan等[10]發(fā)現(xiàn)口服槲皮素能上調(diào)脂聯(lián)素受體和AMPK的表達(dá)，改善PCOS患者的代謝特征。王針織研究表明，槲皮素可通過抑制TLR/核因子-κB信號通路，達(dá)到改善多囊卵巢胰島素抵抗微環(huán)境炎性反應(yīng)，從而逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗[11]。槲皮素已被研究證實(shí)在治療PCOS的肥胖和代謝綜合征中發(fā)揮了有益的作用[12]，其可能是治療多囊卵巢綜合征患者胰島素抵抗、不孕癥及其近期、遠(yuǎn)期并發(fā)癥的一種有效的治療方法[8]。山柰酚作為一種可抑制腫瘤發(fā)生的黃酮類化合物，可能是通過上調(diào)PTEN，失活PI3K/AKT通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬而發(fā)揮作用[13]。山柰酚還能部分抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)，有顯著增加絲氨酸的磷酸化胰島素受體底物1（IRS）、C/EBPα及l(fā)uconeogenic基因的表達(dá)，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)絡(luò)應(yīng)激引起的炎性反應(yīng)和高血糖有一定的保護(hù)作用[14]。Alkhalidy等[15]研究發(fā)現(xiàn)，山柰酚增加了Akt和己糖激酶活性，降低了丙酮酸羧化酶（PC）和葡萄糖-6磷酸酶活性，認(rèn)為山柰酚可能是一種天然存在的抗糖尿病化合物，有抑制葡萄糖的產(chǎn)生和改善胰島素敏感性的作用。相關(guān)臨床與實(shí)驗(yàn)研究表明，β-sitosterol（β-谷甾醇）具有抗糖尿病、調(diào)脂、抗癌、抗風(fēng)濕等作用[16]。β-谷甾醇能干擾多種細(xì)胞信號通路，包括細(xì)胞周期、凋亡、增殖、成活、侵襲、血管生成、轉(zhuǎn)移和炎性反應(yīng)等[17]。漢黃芩素可直接或通過基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18-20]、抗新生血管生成[21]。蛻皮甾醇可以改善微循環(huán)、抗氧化及保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、降低毛細(xì)血管通透性、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和調(diào)節(jié)血管舒縮。陳秋等[22-23]研究發(fā)現(xiàn)蛻皮甾醇在體外可通過肝細(xì)胞發(fā)揮非胰島素依賴的降糖作用，增加胰島素的敏感性并能明顯改善糖代謝。齊墩果酸（OA）是天然三萜類化合物，具有抗糖尿病活性、抗氧化、抗腫瘤[24]、調(diào)節(jié)血脂和抗炎活性的糖苷配基[25]。有人提出OA可以保護(hù)免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞凋亡，這與AKT/eNOS信號通路有關(guān)[26]。OA明顯減弱了Aroclor 1254誘導(dǎo)的胰島素抵抗和葡萄糖和脂質(zhì)參數(shù)的異常變化;OA可通過HNF1b介導(dǎo)的氧化還原穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)來抑制PCBs混合物誘導(dǎo)的氧化損傷和葡萄糖及脂質(zhì)代謝功能障礙[27]。齊墩果酸可通過IRS-1/PI3K/Akt信號通路改善大鼠果糖過度消耗引起的脂肪組織胰島素抵抗[28]。

牛膝藥靶網(wǎng)絡(luò)和PCOS網(wǎng)絡(luò)有22個(gè)重疊基因，富集于90條通路。其中有5個(gè)靶點(diǎn)富集的通路有非洲錐蟲病、甲型流感、瘧疾、糖尿病AGE-RAGE信號通路、核因子-κB信號通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、TNF信號通路、HTLV-I感染、癌癥通路等，細(xì)胞因子中的腫瘤壞死因子（TNF）超家族是一類多功能炎性反應(yīng)遞質(zhì)，可激活與細(xì)胞成活、凋亡、炎性反應(yīng)和細(xì)胞分化相關(guān)的信號通路。其中TNF和核因子-κB信號通路在PCOS的發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用。一項(xiàng)研究顯示TNF-α可增加其自身信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)分子的表達(dá)（P<0.05），并降低脂聯(lián)素及其相關(guān)分子的蛋白質(zhì)水平（P<0.05）[29]。此外，TNF-α增加了核因子-κB的核含量，而核因子-κB抑制劑未觀察到TNF-α誘導(dǎo)的脂聯(lián)素含量降低。TNF-α處理后GLUT-4表達(dá)水平較低（P<0.001）。因此，在人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中，TNF-α高水平可通過降低脂聯(lián)素信號傳導(dǎo)和GLUT-4蛋白質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)而對胰島素作用產(chǎn)生負(fù)面影響。另一項(xiàng)研究顯示：lncRNA SRA改變了胰島素釋放，減輕卵巢損傷，并減少小鼠PCOS中血管生成因子的產(chǎn)生[30]。此外，靶向lncRNA SRA的shRNA抑制了PCOS小鼠和原代顆粒細(xì)胞中卵巢中DHEA誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)遞質(zhì)產(chǎn)生和核因子-κB的核轉(zhuǎn)位。根據(jù)化合物靶點(diǎn)對應(yīng)關(guān)系，牛膝的23個(gè)化合物中，指向ESR1和AR靶點(diǎn)的化合物最多，都為19個(gè)，其他靶點(diǎn)涉及的化合物為：GSK3B（12個(gè)）、ESR2（11個(gè)）、PPARG（11個(gè)）、ADRB2（9個(gè)），因此，ESR1、AR、GSK3B、ESR2、PPARG、ADRB2可能是牛膝在PCOS治療中涉及的關(guān)鍵基因。一項(xiàng)研究顯示，與健康女性相比，來自PCOS女性的卵泡中ESR1基因的表達(dá)較低;ESR1多態(tài)性與胰島素抵抗指數(shù)和FSH水平的關(guān)聯(lián)，強(qiáng)調(diào)了ESR1作為PCOS表型的遺傳修飾物的重要性[31]。一項(xiàng)為了評估PCOS參與的雄激素受體（AR信號候選基因）基因的研究中顯示[32]：許多研究報(bào)道了雄激素受體（AR）基因多態(tài)性CAG重復(fù)序列與PCOS發(fā)生的相關(guān)性，而該薈萃的分析表明AR基因的CAG長度變化與PCOS的發(fā)生無明顯的關(guān)聯(lián)，而CAG長度似乎與PCOS患者的T水平正相關(guān)。另有文獻(xiàn)研究對比發(fā)現(xiàn)牛膝有多種潛在功能，其中止痛、清熱解毒、逐瘀通經(jīng)及消癥功能得到現(xiàn)代臨床和實(shí)驗(yàn)研究的證實(shí)，具有一定消炎止痛、抗病毒、抗腫瘤的作用[33]。Xia等[34]發(fā)現(xiàn)在AR基因外顯子1中（CAG）n的較短等位基因，可能通過上調(diào)AR的活性而引起雄激素過多癥，進(jìn)而增強(qiáng)了對PCOS的易感性。Peng等[35]研究發(fā)現(xiàn)雄激素受體（AR）基因第一外顯子區(qū)域rs6152G/A多態(tài)與PCOS明顯相關(guān)。Mifsud等[36]通過92個(gè)PCOS患者和112個(gè)正常對照組研究發(fā)現(xiàn)在AR基因的外顯子1區(qū)短的CAG重復(fù)序列的長度與無排卵的PCOS患者的低血清雄激素水平有關(guān)。Hickey等[37]研究發(fā)現(xiàn)AR基因的外顯子1區(qū)CAG多態(tài)和甲基化程度與PCOS的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

牛膝治療PCOS具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，是分子間協(xié)同作用的結(jié)果，通過干預(yù)分子網(wǎng)絡(luò)、生物過程及信號通路等機(jī)制，其對PCOS的治療主要是通過補(bǔ)腎活血化瘀以發(fā)揮抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂、促進(jìn)微循環(huán)及改善胰島素抵抗等作用。通過對牛膝靶點(diǎn)成分藥理作用及其可能機(jī)制的回顧，發(fā)現(xiàn)其可能通過多種信號通路、細(xì)胞凋亡、免疫抑制等途徑發(fā)揮其抗糖尿病、調(diào)脂、抗腫瘤、抗炎等作用。目前，關(guān)于多囊卵巢綜合征發(fā)病機(jī)制的研究表明，其多與糖脂代謝紊亂，卵泡顆粒細(xì)胞凋亡受阻、細(xì)胞炎性反應(yīng)因子等有關(guān)。因此，我們對牛膝化合物成分-PCOS靶點(diǎn)的研究將為中藥治療PCOS提供藥理學(xué)的理論支持。

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（2019-08-22收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）