重 結(jié) 晶 法 制 備 次 氯 血 紅 素

修志明, 林 琳, 周 朋, 王麗萍

(1. 吉林大學 生命科學學院, 長春 130012； 2. 北華大學 藥學院, 吉林 吉林 132013；3. 海南大學 農(nóng)學院, ?？?570228)

自然界中許多天然過氧化物酶均以血紅素(Heme)作為輔基, 通過血紅素卟啉環(huán)的Fe3+與組氨酸側(cè)鏈基團上N原子配位構(gòu)成酶的催化中心[1-2]. 由于血紅素上的乙烯基易被過氧化物氧化而影響酶的穩(wěn)定性, 因此在設計過氧化物模擬酶時,可將血紅素轉(zhuǎn)化為次血紅素[3]. 次氯血紅素(Deuterohemin)屬于三價鐵卟吩衍生物, 化學名稱為3,7,12,17-四甲基-21H,23H-卟吩-2,18-二丙酸氯化鐵, 分子式為[C30H28FeN4O4]+Cl-, 分子量為599.87. 以次氯血紅素分子為基礎設計的次氯血紅素-短肽化合物研究和應用目前已有較多報道[4-14].

通常利用間苯二酚對氯化血紅素的C-烷基化反應制得次氯血紅素[15]. 目前的次血紅素合成方法存在工藝繁瑣、 收率低[16]或純度低[17]等缺點. 本文以氯化血紅素為原料, 經(jīng)間二苯酚還原, 合成了次氯血紅素. 采用多次重結(jié)晶方法獲得了質(zhì)量分數(shù)和收率均較高的產(chǎn)物, 該方法簡單易行、 可大規(guī)模生產(chǎn)高質(zhì)量分數(shù)的次氯血紅素.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 氯化血紅素 (天津市生命科學應用研究所)； 間苯二酚、 N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、 三氟乙酸(TFA)、 乙酸乙酯、 二氯甲烷、 氫氧化鈉和鹽酸均為國產(chǎn)分析純.

液相色譜儀(LC-2010HT, 日本島津公司)和布魯克基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜儀(ultrafleXtreme MALDI TOF/TOF, 美國布魯克公司).

1.2 方 法

1.2.1 次氯血紅素的合成 將10 g血紅素與40 g間苯二酚混合置于三口瓶中, 油浴120 ℃攪拌30 min, 升至150 ℃反應30 min, 180 ℃反應20 min, 薄層色譜(TLC)監(jiān)測至反應完全, 自然冷卻至120 ℃后倒入10 L熱水中, 攪拌, 過濾, 干燥, 稱量, 制得次血紅素粗品, 合成路線如圖1所示. 采用液相色譜檢測其質(zhì)量分數(shù)(歸一化法).

圖1 次氯血紅素的合成Fig.1 Synthesis of deuterohemin

液相色譜條件： 檢測波長為390 nm； 色譜柱為C18柱(5 μm, 4.6 mm×250 mm)； 流動相為含w(TFA)=1%的V(乙腈)∶V(水)=35∶65溶液.

1.2.2 次氯血紅素的重結(jié)晶 先將9.0 g次血紅素粗品與0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液4.5 L混合后, 加入0.45 L DMF攪拌溶解, 過濾, 濾液用鹽酸調(diào)至中性, 析出沉淀, 靜置, 棄去上清液, 過濾, 收集沉淀. 重復操作2次, 將所得產(chǎn)物于120 ℃烘干1 h, 稱重, 再用液相色譜檢測其質(zhì)量分數(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 間苯二酚用量對次氯血紅素合成的影響 按1.2.1合成方法, 先將氯化血紅素與間苯二酚分別以1∶3,1∶4,1∶5,1∶6的質(zhì)量比投入反應, 制得次氯血紅素粗品, 再用液相色譜檢測其質(zhì)量分數(shù), 結(jié)果列于表1.

表1 間苯二酚用量對次氯血紅素合成的影響

由表1可見, 當m(間苯二酚)∶m(氯化血紅素)≤3時, 所得粗品的產(chǎn)率和質(zhì)量分數(shù)均較低；m(間苯二酚)∶m(氯化血紅素)≥6時, 粗品的產(chǎn)率較高, 但過量的間苯二酚需在純化步驟中除去, 既浪費試劑， 也降低了產(chǎn)物的質(zhì)量分數(shù).

2.2 反應溫度對次氯血紅素合成的影響 按1.2.1合成方法, 先將氯化血紅素與間苯二酚分別于170,180,190 ℃反應20 min, 制得次氯血紅素粗品, 再用液相色譜檢測其質(zhì)量分數(shù), 結(jié)果列于表2.

表2 反應溫度對次氯血紅素合成的影響

由表2可見: 當反應溫度≤170 ℃時, 粗品的產(chǎn)率較低； 當反應溫度≥190 ℃時, 副反應增加, 粗品的產(chǎn)率和質(zhì)量分數(shù)均降低.

2.3 反應時間對次氯血紅素合成的影響 按1.2.1合成方法, 先將氯化血紅素與間苯二酚于180 ℃分別反應10,20,30 min, 制得次氯血紅素粗品, 再用液相色譜檢測其質(zhì)量分數(shù), 結(jié)果列于表3.

表3 反應時間對次氯血紅素合成的影響

由表3可見: 當反應時間≤10 min時, 反應不充分, 產(chǎn)量較低； 當反應時間≥30 min時, 反應時間過長, 副反應增加, 粗品的產(chǎn)率和質(zhì)量分數(shù)均下降.

2.4 重結(jié)晶溶劑對次氯血紅素純化的影響 先取1.2.1方法制得的次氯血紅素粗品30 g, 分成3份, 每份10 g, 按1.2.2方法將其分別加入0.45 L的乙酸乙酯、 DMF和二氯甲烷中進行重結(jié)晶, 制得次氯血紅素純品, 計算收率, 再用液相色譜檢測其質(zhì)量分數(shù), 結(jié)果列于表4.

表4 重結(jié)晶溶劑對次氯血紅素純化的影響

由表4可見: 當溶液為中性或酸性時, 次氯血紅素從溶液中析出, 雜質(zhì)保留在結(jié)晶母液中, 達到了純化目的; 乙酸乙酯和二氯甲烷與二甲基甲酰胺相比, 其純化效果較差.

2.5 重結(jié)晶溶劑比例對次氯血紅素純化的影響 先取1.2.1方法制得的次氯血紅素粗品30 g, 分成3份, 每份10 g, 按1.2.2方法將其分別加入0.225,0.45,0.9 L DMF中, 制得次血氯紅素純品, 計算收率, 再用液相色譜檢測其質(zhì)量分數(shù), 結(jié)果列于表5.

表5 重結(jié)晶溶劑比例對次氯血紅素純化的影響

由表5可見: 當V(DMF)=0.225 L時, 次氯血紅素及雜質(zhì)均在溶液中, 即溶劑化不充分; 當溶液為中性或酸性時, 次氯血紅素與雜質(zhì)同時析出, 導致其質(zhì)量分數(shù)較低； 當V(DMF)=0.90 L時, 次氯血紅素及雜質(zhì)在溶液中溶劑化較充分, 析出次氯血紅素的質(zhì)量分數(shù)較高, 但溶劑過量, 使產(chǎn)率過低.

綜上所述, 本文以氯化血紅素為原料, 經(jīng)間苯二酚還原制得次氯血紅素粗品. 通過實驗對比, 得到最佳反應條件:m(氯化血紅素)∶m(間苯二酚)=1∶4 ; 反應溫度為180 ℃; 反應時間為20 min. 選用0.45 L DMF做溶劑、 重結(jié)晶10 g 粗產(chǎn)品所得次氯血紅素的質(zhì)量分數(shù)大于95%、 產(chǎn)率大于85%. 該方法操作簡單、 安全可控、 純化效果好、 可以大規(guī)模生產(chǎn).

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