188Re標(biāo)記葉酸偶聯(lián)白蛋白納米微球?qū)KOV3人卵巢癌生長(zhǎng)抑制作用研究*

唐秋莎 陳道楨 臧 嘉 郭彩琴

卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌[1]。目前，卵巢癌的治療以手術(shù)為主，并聯(lián)合化療與放療。晚期卵巢癌治療后常易復(fù)發(fā)，一旦復(fù)發(fā)，治療極為困難，5年存活率一般只能達(dá)到20%～30%[2]。所以，積極探索新的治療藥物和方法具有十分重要的意義[3-5]。本研究在前期工作基礎(chǔ)上[6]，觀察核素標(biāo)記葉酸靶向白蛋白納米微球(188Re-folate-CDDP/HAS MNP)對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3體內(nèi)生長(zhǎng)的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器188Re-folate-CDDP/HAS MNP[7]、四氧化三鐵納米磁粒由本室自制[8]；小牛血清、McCOY’s 5A培養(yǎng)基、葉酸(Sigma)，注射用順鉑(山東齊魯制藥有限公司)，人血清白蛋白(上海生工生物科技有限公司)。188W/188Re發(fā)生器（上?？菩鹿荆?，SPG-06A高頻感應(yīng)加熱設(shè)備：頻率230 kHz，功率4 kW，輸出交變加熱電流5～30 A（深圳雙平高頻加熱器廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)BALB/C裸鼠64只，雌性，4周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（滬）2002-0010。

1.3 方法

1.3.1 SKOV3人卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3人卵巢癌細(xì)胞接種于含10%小牛血清的McCOY’s 5A培養(yǎng)液中，在37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.3.2188Re-folate-CDDP/HAS MNP對(duì)SKOV3人卵巢癌細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用 （1）裸鼠卵巢癌移植瘤模型的建立：將Balb/c nu/nu荷人SKOV3瘤株裸小鼠頸椎脫臼處死，浸入75%乙醇1 min，無菌條件下取出腫瘤，剝除表面纖維包膜，將腫瘤切為1 mm3的瘤塊，浸入4℃生理鹽水備用。Balb/c nu/nu裸小鼠乙醚麻醉后消毒右肩背皮膚，用12號(hào)注射針頭穿破皮膚，將瘤塊吸入14號(hào)上頜竇穿刺針通過皮下隧道種植在右肩胛部皮下，用絡(luò)合碘棉球加壓消毒穿刺處皮膚。待小鼠清醒后放入另一消毒飼養(yǎng)盒內(nèi)。（2）建瘤成功的荷瘤鼠實(shí)驗(yàn)分組及治療：接種瘤塊7 d后，即可觀察到腫瘤在小鼠皮下膨脹性生長(zhǎng)，30～35 d后，移植瘤長(zhǎng)徑即可達(dá)0.5 cm左右。除去腫瘤生長(zhǎng)過快和過慢的荷瘤鼠，將64只腫瘤長(zhǎng)至0.5 cm的荷瘤鼠隨機(jī)分為8組，每組8只。（A）陰性對(duì)照組：注入0.1 mL1640培養(yǎng)液。（B）單純化療組：folate-CDDP/HAS MNP，不加磁場(chǎng)。（C）單純放療組：188Re-folate-HAS MNP，不加磁場(chǎng)。（D）單純熱療組：folate-HAS MNP，加磁場(chǎng)。（E）化療聯(lián)合放療組：188Re-folate-CDDP/HAS MNP，不加磁場(chǎng)。（F）化療聯(lián)合熱療治療組：folate-CDDP/HAS MNP，加磁場(chǎng)。(G)放療聯(lián)合熱療治療組：188Re-folate-HAS MNP，加磁場(chǎng)。(H)熱療、化療、放療聯(lián)合治療組：0.1 mL188Re-folate-CDDP/HAS MNP,加磁場(chǎng)。白蛋白納米球濃度為20 mg/kg，約含CDDP 3 mg/kg，放射性強(qiáng)度約為22.2 MBq。注射上述藥物處理24 h后，將D、F、G、H4組移入交變磁場(chǎng)，0.5%的戊巴比妥鈉溶液60 mg/kg腹腔注射，待完全麻醉后置高頻感應(yīng)加熱器下照射（接種部位位于板式線圈中央）。經(jīng)確認(rèn)腫瘤中心與磁場(chǎng)中心重疊。在交變磁場(chǎng)下加熱30 min。相同方法共熱療3次，間隔時(shí)間為48 h。治療時(shí)測(cè)量治療區(qū)和其周圍區(qū)域的溫度變化情況。（3）腫瘤質(zhì)量抑制率：從熱療后的第2天開始觀察各組荷瘤鼠及腫瘤的生長(zhǎng)情況并分別予以記錄和拍照，至治療周期結(jié)束(6周)后，用脫臼法處死荷瘤鼠并剝離出腫瘤，用電子天平稱瘤質(zhì)量，依公式計(jì)算腫瘤質(zhì)量抑制率（%）=(1-實(shí)驗(yàn)組腫瘤質(zhì)量/對(duì)照組腫瘤質(zhì)量)×100%。（4）大體形態(tài)及病理組織學(xué)觀察：在治療過程中觀察各組腫瘤表面的皮膚改變，治療結(jié)束后取出各組腫瘤，觀察外觀大小、顏色、形態(tài)，取各組全部腫瘤組織、心、肝、脾、腎、肺等，經(jīng)4%中性甲醛固定、取材、脫水、透明、石蠟包埋、切片脫蠟、HE染色、封片，光鏡下形態(tài)學(xué)觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用x±s表示，行t檢驗(yàn)和單因素方差分析，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤質(zhì)量抑制率 各治療組的腫瘤質(zhì)量均低于對(duì)照組（Plt;0.05），熱療、化療、放療聯(lián)合治療組的腫瘤質(zhì)量低于其他治療組（Plt;0.05），見表1。

Table 1 Comparison of the quality and inhibitory rate of tumor between eight groups表1 各組腫瘤質(zhì)量及抑制率比較

2.2 大體形態(tài)改變 在整個(gè)治療過程中，熱療組腫瘤表面的皮膚時(shí)有出血、壞死及焦痂形成，有的焦痂可脫落，而對(duì)照組及未加熱組少見此種改變；在治療周期結(jié)束后，取出各組腫瘤組織發(fā)現(xiàn)加材料熱療組腫瘤均呈黑褐色及灰白色相間外觀、病理證實(shí)為注入的納米磁性粒子，對(duì)照組腫瘤呈灰白色、顏色較均勻一致；對(duì)照組腫瘤隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，表面光滑，未見出血壞死，治療組腫瘤在整個(gè)治療周期中逐漸減小，部分表面凹凸不平，時(shí)有出血壞死。

2.3 病理組織學(xué)改變 光學(xué)顯微鏡組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤組織為低分化癌；熱療、化療、放療聯(lián)合治療組部分腫瘤組織明顯出血、壞死，其間可見黑色磁性納米粒沉積，部分腫瘤組織正常，在二者交界處有炎癥反應(yīng)帶及淋巴細(xì)胞浸潤，而對(duì)照組腫瘤組織壞死較輕、炎癥反應(yīng)及淋巴細(xì)胞浸潤也不明顯，見圖1、2。

3 討論

近年來，以葉酸介導(dǎo)藥物靶向腫瘤細(xì)胞的研究逐漸成為熱點(diǎn)[9]。本文采用包裹化療藥物(順鉑)、磁粒的白蛋白納米微球，并在其表面偶聯(lián)葉酸及標(biāo)記放射性核素188Re[7]，利用葉酸受體在腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的特點(diǎn)[10]，對(duì)腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)靶向性的熱療、化療、放療三重殺傷作用。

在體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)中，首先需制備移植瘤模型。由于卵巢癌的生理特點(diǎn)，未見卵巢癌原位動(dòng)物模型的報(bào)道，故本文采用在小鼠腋下接種SKOV3腫瘤細(xì)胞的異位移植瘤模型。在SKOV3建立異位卵巢癌的過程中發(fā)現(xiàn)，SKOV3細(xì)胞直接接種于裸鼠皮下潛伏期長(zhǎng)，約7 d左右可見開始生長(zhǎng)，25 d后生長(zhǎng)較快，但長(zhǎng)勢(shì)不太均勻。故本實(shí)驗(yàn)先將SKOV3細(xì)胞于裸鼠皮下接種，待瘤塊長(zhǎng)至合適大小后，超凈臺(tái)上無菌環(huán)境下，處死裸鼠，剝?nèi)×鰤K，分割成大小均勻的小塊，再用穿刺針穿刺注入裸鼠皮下，10 d以后，可見腫瘤長(zhǎng)勢(shì)良好。這樣可減少組間腫瘤本身大小差異對(duì)藥效評(píng)價(jià)的影響。

近年來，腫瘤綜合治療的研究發(fā)展迅速，大量體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)均證明熱療聯(lián)合放療、化療可以明顯增強(qiáng)彼此的治療效果。熱療可以抑制多重耐藥菌（MDR）1和多重耐藥相關(guān)基金(MRP)的表達(dá)從而對(duì)抗多藥耐藥性，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)藥物濃度[11]。熱療還可以大大增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性[12]，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但在聯(lián)合治療方式中，往往化療藥物和熱量缺乏靶向性，技術(shù)方面也很難達(dá)到控溫和恒溫的要求，本實(shí)驗(yàn)以白蛋白磁性納米微球?yàn)檩d體，以葉酸受體為作用靶點(diǎn)，將化療、熱療、核素放療三者有機(jī)結(jié)合起來。特異性方面，利用葉酸受體配體高親合性的生物靶向性，以保證治療安全性[13]；在治療作用方面，結(jié)合化療及核輻射的定向殺傷作用和磁感應(yīng)升溫的物理治療，以達(dá)到治療的有效性[14]，磁感應(yīng)加熱的模式也在一定程度達(dá)到了控溫和恒溫的要求。本研究結(jié)果表明，各治療組的腫瘤質(zhì)量均低于對(duì)照組，且與其他治療組相比，熱療、化療、放療聯(lián)合治療組對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用最為顯著。

本研究組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)許多均一性棕黃色的磁性納米粒聚集在腫瘤周邊的基質(zhì)中，該材料沉積部位附近多數(shù)腫瘤細(xì)胞消失，并且在材料周圍可見壞死區(qū)域。然而熱療過程中不可避免的技術(shù)難題是使腫瘤組織均勻升溫達(dá)到所需的溫度而不損傷腫瘤周圍正常組織。為了解決該難題，本研究采用了按順時(shí)針3、6、9、12點(diǎn)多點(diǎn)注射的方法將納米粒注入腫瘤瘤體內(nèi)。結(jié)果顯示該方法對(duì)腫瘤周圍正常組織損傷小、升溫均勻、材料具有很好的彌散性。

Figure 1 Results of hematoxylin and eosin staining in transplanting human ovarian cancer after treatment with combined therapy of hyperthermia,chemotherapy and radiotherapy(×400)圖1 熱療、化療、放療聯(lián)合治療組移植性卵巢癌HE染色圖(×400)

Figure 2 Results of hematoxylin and eosin staining in transplanting human ovarian cancer of negative control group(×400)圖2 對(duì)照組裸鼠卵巢癌移植瘤HE染色圖(×400)

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