劉侯俊,李雪平,韓曉日,2*,高曉寧
(1沈陽農(nóng)業(yè)大學土地與環(huán)境學院,土肥資源高效利用國家工程實驗室,沈陽110866;2沈陽農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,遼寧省生物炭工程技術(shù)中心,沈陽110866;3遼寧省環(huán)境科學研究院,遼寧沈陽110161)
鐵氧化物膠膜(鐵膜)是水生植物通過體內(nèi)發(fā)達的通氣組織將空氣中的O2運輸?shù)礁?,根系向外分泌的O2與其它氧化性物質(zhì)將土壤中高濃度的還原性Fe2+、Mn2+等氧化成溶解性很小的氧化物和氫氧化物,并沉積在土壤和根系表面而形成的[1]。水稻是一種典型的濕生植物,其根系表面也沉積著大量鐵膜[2-6]。已有研究表明,水稻根表鐵膜可以影響多種元素在水稻體內(nèi)的吸收與分布。大多數(shù)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),植物根表鐵膜對元素的吸收具有明顯的阻擋作用[7-10],也有研究證明,鐵膜這種阻擋作用非常有限[11-13],甚至可以促進植物對養(yǎng)分的吸收[14-16]。
鎘(Cd)是一種對生物體產(chǎn)生巨大危害的重金屬元素,它可以通過多種途徑進入農(nóng)田土壤中,導致土壤中Cd的累積量增加。例如,F(xiàn)u等分析了浙江省6個不同地區(qū)稻田土壤樣品以及相應(yīng)的水稻子粒樣品,結(jié)果發(fā)現(xiàn)土壤中 Cd的平均含量為1.19 μg/g,是土壤最大允許值(0.3 μg/g)的4.0 倍,子粒樣品中有 31% 超過最大允許值(0.2 μg/g)[17]。Ji等[18]的田間調(diào)查結(jié)果也發(fā)現(xiàn),在所調(diào)查的32個稻田土壤及相應(yīng)的水稻子粒樣品中,有15個土壤樣品Cd含量超過了1.0 μg/g,5個子粒樣品中Cd含量超過了0.2 μg/g。可見稻田土壤中Cd污染狀況不容樂觀。
Cd的存在不僅影響水稻自身的生長與代謝,同時影響到水稻對其它必需營養(yǎng)元素的吸收運輸以及這些元素在水稻體內(nèi)功能的發(fā)揮。其中Cd與Fe、Mn、Cu、Zn等幾種微量元素之間的關(guān)系研究較多。植物對Cd的吸收和運輸往往是借助于Fe和其它二價離子的吸收系統(tǒng)進行的[19-20],因此 Cd經(jīng)常與這些二價離子在吸收運輸,甚至代謝過程中產(chǎn)生競爭作用,以至抑制了植物對Fe等離子的吸收。反過來,缺乏這些元素也可以增加植物對 Cd的吸收[21-22]。
Fe、Mn、Cu、Zn等微量元素是對植物生長發(fā)育非常重要的必需營養(yǎng)元素,但目前稻米中微量元素缺乏現(xiàn)象非常嚴重,以至嚴重影響到人類對微量元素的攝取,并引發(fā)一系列人體微量元素缺乏病癥[23]。因此,研究水稻對微量元素的吸收運輸以及影響因素具有非常重要的理論和實際意義。如前所述,鐵膜和Cd均可以影響到水稻對一些元素的吸收,而兩者同時存在的前提下它們?nèi)绾斡绊懰緦n、Cu、Zn吸收,這正是本研究試圖探討的問題。
本論文針對稻田土壤中有效Fe2+含量較高,同時又有重金屬Cd污染的現(xiàn)狀,利用水稻根表可以利用Fe2+形成大量鐵膜的生物學特性,在人工模擬Cd污染的前提下,探索根表鐵膜對水稻吸收運輸Cd、Fe、Mn、Cu和Zn的影響。
水稻(Oryza sativa L.)種子用30%的 H2O2表面消毒30 min后,用飽和CaSO4浸泡6小時,在濕潤濾紙上催芽。將露白的種子播于濕潤的石英砂中(石英砂用5%的HCl浸泡過夜,依次用自來水和去離子沖洗至pH 7.0),石英砂用黑色塑料布覆蓋遮光。待水稻出苗后將其揭開,保持石英砂濕潤以避免水稻缺水。水稻出苗10天后,挑選生長一致的幼苗,移栽到5 L的陶瓷盆中,盆中供應(yīng)pH 5.0的營養(yǎng)液[營養(yǎng)液組分含量(mol/L):NH4NO30.5×10-3,NaH2PO4·2H2O 0.6 × 10-4,K2SO40.23 ×10-3,MgSO4·7H2O 0.16 × 10-3,CaCl20.21 × 10-3,MnCl2·4H2O 5.0 × 10-7,(NH4)6Mo7O24·4H2O 5.0× 10-8,CuSO4·5H2O 1.0 × 10-8,ZnSO4·7H2O 5.0×10-7,H3BO32.0 × 10-7,F(xiàn)e-EDTA 1.0 × 10-4]。幼苗前7天供以1/2強度營養(yǎng)液,以后為完全營養(yǎng)液,每隔7天換一次營養(yǎng)液。水稻在營養(yǎng)液中預培養(yǎng)26天。
營養(yǎng)液培養(yǎng)試驗:選生長一致的幼苗移栽到1 L陶瓷盆中,每盆4株。供應(yīng)含有0、10、30、50、80、100 mg/L Fe(FeSO4·7H2O)的營養(yǎng)液,此時營養(yǎng)液中不再供應(yīng)EDTA-Fe和P。水稻生長3 d后進行同樣的處理,此時,水稻根表已形成明顯的紅棕色鐵膜。水稻在正常營養(yǎng)液中生長1 d后,再生長于0、0.1、1.0 mg/L Cd(3CdSO4·8H2O)的營養(yǎng)液中2 d。因為在含Cd的營養(yǎng)液中生長的過程中,水稻根系長出許多新根和從根尖延伸出新的根段,為了使這些根段全部被鐵膜覆蓋,再次向水稻供應(yīng)Fe營養(yǎng)液,濃度和方法同上。供應(yīng)3 d后再次供應(yīng)含Cd的營養(yǎng)液,同樣為2 d,之后收獲。試驗包括18個處理,每處理重復3次,共54盆。
土壤培養(yǎng)試驗:選生長一致的幼苗移栽到土壤中繼續(xù)生長,每盆2株。試驗用土壤屬于灰色沖積性水稻土,土壤有機質(zhì)含量為19.62 g/kg,全氮1.84 g/kg,Olsen-P 17.9 mg/kg,速 效 鉀 34.0 mg/kg,DTPA-Fe 34.9 mg/kg,DTPA -Cd 0.227 mg/kg,pH(水∶土10∶1)6.2。將自然風干的土壤過3 mm篩,并施以 N 0.2 g/kg土,P2O50.15 g/kg土,K2O 0.2 g/kg土的基肥,以分析純化合物[(NH4)2SO4、KH2PO4、K2SO4]配成溶液,先與少量土壤充分混合,再將這些土壤與其他土壤混勻。每10 kg土壤混一次基肥,最后將所有試驗用土壤再充分混勻。將 Cd(3CdSO4·8H2O)和 Fe(FeSO4·7H2O)以溶液的形式與一定量已施入基肥的土壤充分混勻,各處理分別混合均勻,每次施入肥料,在混勻的過程中均過3 mm篩。土壤中添加Cd和Fe的濃度分別為Cd 0、2、10 mg/kg,F(xiàn)e 0、1、2 g/kg。
將準備好的土壤裝入10(直徑)×20(高)cm的塑料盆,每盆裝土600 g。先在盆底裝少量土,之后將孔徑為30 μm的空尼龍網(wǎng)袋(8 cm×20 cm)放入盆中央,再將剩余土壤裝入盆中,此時網(wǎng)袋被固定在盆中央。網(wǎng)袋的作用在于減少根系與土壤的直接接觸,收獲時可得到相對干凈完整的根系,但網(wǎng)袋不能阻止水分和養(yǎng)分在網(wǎng)袋內(nèi)外的流動。裝盆完畢,每盆加等量去離子水保持土壤濕潤,平衡兩周。水稻移栽后,保持水面約2 cm,移栽后43 d收獲。試驗共9個處理,重復5次,共45盆。
營養(yǎng)液培養(yǎng)試驗:收獲時從盆中選取一株水稻,用去離子水沖洗3次,然后從莖基部將水稻幼苗地上部和根系分開。地上部稱鮮重后,裝入紙袋。根系用DCB(Dithionite-Citrate-Bicarbonate)法提取根表鐵膜中的微量元素,具體操作如下:將植株整個根系放入100 mL燒杯中,加30 mL濃度為0.03 mol/L Na3C6H5O7.H2O和0.125 mol/L NaHCO3混合提取液(及時配制)及0.6 g Na2S2O4,根系在25℃下靜置浸泡60分鐘用于提取根表鐵膜,將提取液移入50 mL容量瓶,將根系用去離子水沖洗三次,沖洗的液體一并轉(zhuǎn)移到容量瓶中定容,然后將液體過濾到膠卷盒中。提取后的根系與地上部放在烘箱里70℃下烘干,并稱干重。
土壤培養(yǎng)試驗:收獲時取出網(wǎng)袋,將水稻植株從網(wǎng)袋中拿出,洗去粘附在根系上的少量土壤,根系表面呈現(xiàn)明顯的紅棕色鐵膜,從莖基部將地上部和根系分開。稱地上部鮮重后裝入編號的紙袋中,根系裝入封口袋,盡快運回實驗室。根系用去離子水沖洗三次,置于150 mL燒杯中用DCB方法提取根系表面的鐵膜。由于土壤培養(yǎng)條件下水稻根系較大,提取根表鐵膜時加大提取液中各組分的用量,提取具體過程為:燒杯中加80 mL含0.03 mol/L Na3C6H5O7·2H2O和0.125 mol/L NaHCO3的提取液,再加1.6 g固體的Na2S2O4,25℃下靜置70 min,此時根系由紅色轉(zhuǎn)為白色,根表的鐵膜溶解在提取液中。將提取液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中,根系再用去離子水沖洗三次,沖洗液一并移入容量瓶中,定容后,搖勻過濾到塑料瓶中待測。
將烘干的根和地上部樣品粉碎,準確稱量0.1600 g根和0.3000 g地上部樣品到消煮管中,加入5 mL濃硝酸和1 mL混合酸(HNO3∶HClO4=1∶1),過夜。第二天在消煮爐上消煮至少10 h,直到消煮管中溶液完全轉(zhuǎn)白色且消煮管中剩余液體大約為1 mL時為止。消煮溫度和時間依次為90℃ 3 h,140℃ 5 h,180℃ 2 h。待消煮管冷卻后,將消煮液轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中,用高純水將消煮管沖洗三次,定容,再過濾到膠卷盒中。用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(ICP -OES,Optima3300 DV,Perkin Elmer,USA)測定塑料盒中的DCB提取液和消煮液中的微量元素。為了保證樣品消煮和測定過程的準確性,空白試劑和西紅柿葉片標準樣品(GSB 07-1264-2000,Chinese National Certified Reference Material)與試驗樣品同步進行消煮和測定。標準樣品測定值均在標準值范圍之內(nèi)。
營養(yǎng)液培養(yǎng)水稻幼苗生長于沈陽農(nóng)業(yè)大學土地與環(huán)境學院植物營養(yǎng)系培養(yǎng)室中,培養(yǎng)室濕度為70%,溫度為22 25℃,光照時間14 h/10 h(白天/晚上),光照強度為 120 150 μmol/(m2·s),移栽后再生長60 d。
土壤培養(yǎng)水稻試驗布置于沈陽農(nóng)業(yè)大學土地與環(huán)境學院植物營養(yǎng)系網(wǎng)室中,白天/晚上溫度一般為30℃/15℃,濕度為60% 70%。
采用EXCEL進行數(shù)據(jù)處理,統(tǒng)計分析采用SAS 8.2系統(tǒng)(SAS Institute Inc.,Cary,NC,USA)進行雙因素方差分析。同一Cd水平不同F(xiàn)e處理之間進行多重比較(P<0.05)。
兩種培養(yǎng)方式下,水稻根系表面的鐵膜均隨介質(zhì)中Fe供應(yīng)量的增加而顯著增加(表1、表2)。土壤中未供應(yīng)Fe時,水稻根表的Fe含量遠遠高于營養(yǎng)液中未供應(yīng)Fe時,說明水稻利用了土壤中本身存在的Fe,從而形成了大量鐵膜。
表1 營養(yǎng)液方式下不同鐵鎘處理下鐵膜數(shù)量(mg/kg)Table 1 Amounts of the iron plaque in root surface of rice in the hydroponics culture experiments
表2 土壤培養(yǎng)方式下不同鐵鎘處理下鐵膜數(shù)量(mg/kg)Table 2 Amounts of the iron plaque in root surface of rice in soil culture experiments
圖1顯示,營養(yǎng)液培養(yǎng)方式下,0.1 mg/L Cd(Cd0.1)處理時,水稻根表鐵膜中Cd(DCB-Cd)為加Fe處理高于未加Fe處理,而在1.0 mg/L Cd(Cd1.0)處理時,根表鐵膜中Cd則為加Fe處理低于未加Fe處理。土壤培養(yǎng)方式下,水稻根表鐵膜中Cd隨著土壤中供Fe濃度的增加而增加。兩種培養(yǎng)方式下,水稻根中和地上部Cd含量均隨介質(zhì)中供應(yīng)Fe濃度的增加而降低,且高Cd供應(yīng)時下降幅度大于低Cd供應(yīng),這在土壤培養(yǎng)條件下更為顯著。
兩種培養(yǎng)方式下,根中Cd含量遠遠高于根表鐵膜中和地上部Cd含量。如營養(yǎng)液培養(yǎng)方式下,水稻根系吸收Cd占植株Cd吸收總量的54%~71%,而鐵膜中Cd占2% 9%,地上部Cd占24%~40%。土壤培養(yǎng)方式下,三者分別是30%~70%、1%~47%、17%~37%。
圖1 營養(yǎng)液和土壤培養(yǎng)方式下水稻根表、根中和地上部鎘含量Fig.1 Concentrations of Cd in root surface,roots and shoots in the hydroponics and soil culture experiments
圖2顯示,不管營養(yǎng)液培養(yǎng)還是土壤培養(yǎng)條件下,水稻根表鐵膜中Mn均在高Fe供應(yīng)時高于低Fe供應(yīng)和無Fe供應(yīng)。而水稻根中和地上部Mn含量則是供Fe處理顯著低于未供Fe處理,而且地上部下降幅度大于根中下降幅度。在營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下,Cd也降低根系和地上部Mn含量,而土壤培養(yǎng)條件下此規(guī)律不明顯。
營養(yǎng)液培養(yǎng)方式下,水稻根中Mn含量最低,根表鐵膜中和地上部Mn含量接近。土壤培養(yǎng)方式下,則是地上部Mn含量最高,其次是根中,根表鐵膜中最低。Mn在植物體內(nèi)的分布規(guī)律一般都是地上部大于根部[24-25],尤其在外源添加 Mn 的情況下,地上部Mn的分配比例更高[26],說明Mn是一種很容易從根系向地上部運輸?shù)脑?。本試驗中水稻生長的淹水環(huán)境中,Mn被還原為Mn2+,其植物有效性很強,相當于外源供應(yīng)多余的Mn,所以地上部Mn含量最高。
圖3顯示,營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下,水稻根表鐵膜中Cu在高Fe供應(yīng)時高于低Fe供應(yīng)和無Fe供應(yīng)。而在土壤培養(yǎng)條件下,根表鐵膜中Cu則是供Fe處理低于未供Fe處理,這與前面兩種元素變化規(guī)律不同。營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下,水稻根中和地上部Cu含量除個別處理低以外,其它處理之間未呈現(xiàn)明顯的規(guī)律。而在土壤培養(yǎng)條件下,水稻根中和地上部Cu含量則是供Fe處理低于未供Fe處理。在土壤培養(yǎng)條件下,Cd也有降低根系和地上部Cu含量的趨勢,而在營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下此規(guī)律不明顯。這與Cd對Mn的影響呈現(xiàn)不同的規(guī)律。
圖2 營養(yǎng)液和土壤培養(yǎng)方式下水稻根表、根中和地上部錳含量Fig.2 Concentrations of Mn in root surface,roots and shoots in the hydroponics and soil culture experiments
營養(yǎng)液培養(yǎng)方式下,水稻根表鐵膜中、根中以及地上部Cu含量接近。但土壤培養(yǎng)條件下,三者差異很大,根中Cu含量遠遠高于根表鐵膜中和地上部,有的處理根中Cu含量達到鐵膜中和地上部的10倍左右。
圖4顯示,不管營養(yǎng)液培養(yǎng)還是土壤培養(yǎng)條件下,水稻根表鐵膜中Zn在不同F(xiàn)e處理之間均未呈現(xiàn)明顯規(guī)律,而根中和地上部Zn(土培條件下除外)含量則隨著介質(zhì)中供Fe濃度的增加而呈現(xiàn)下降趨勢。兩種培養(yǎng)方式下Cd在一定程度上降低了根系和地上部Zn含量。
營養(yǎng)液培養(yǎng)方式下,水稻根表鐵膜中Zn含量遠遠高于根中和地上部,而土壤培養(yǎng)條件下,三者差異不大,根中Zn含量略高于根表鐵膜和地上部。
圖3 營養(yǎng)液和土壤培養(yǎng)方式下水稻根表、根中和地上部銅含量Fig.3 Concentrations of Cu in root surface,roots and shoots in the hydroponics and soil culture experiments
本試驗中,生長介質(zhì)中供應(yīng)不同濃度Fe,能夠誘導水稻根表形成大量鐵膜,而且鐵膜量隨著生長介質(zhì)中Fe濃度的增加而增加。然而DCB提取的鐵膜中Cd、Mn、Cu、Zn含量大多數(shù)情況下,并沒有隨著鐵膜量的增加而增加。如營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下,在高濃度Cd供應(yīng)時,鐵膜的增加還減少了其中Cd含量。鐵膜中Zn含量則隨鐵膜量的增加未呈現(xiàn)明顯的變化規(guī)律,鐵膜中Mn和Cu也只在高量Fe供應(yīng)時才有所增加(營養(yǎng)液培養(yǎng)Cu除外)。在土壤培養(yǎng)條件下,鐵膜中Cd和Mn隨鐵膜量增加有一定程度的增加,但與鐵膜自身的增加幅度相比卻小的多。
由此可見,不同元素不僅被鐵膜吸附的程度不同,而且向根中運輸?shù)谋壤膊煌渲蠧d元素是最不容易被鐵膜吸附的元素,不管在土壤培養(yǎng)還是營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下,大部分Cd都可以通過鐵膜進入根中,且與其它元素相比,Cd在鐵膜中的比例更小,向根中運輸?shù)哪芰Ω?,鐵膜中Cd與根中Cd含量在土壤培養(yǎng)和營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下相差倍數(shù)最高分別達到100倍和10倍,說明鐵膜對Cd的阻擋能力有限,其原因可能是Cd本身在土壤-植物系統(tǒng)中的移動性較強,加之水稻對Cd的吸收累積能力較大[27]。對于Mn、Zn、Cu三種元素,不同培養(yǎng)體系下鐵膜對它們的吸附情況各不相同,營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下,Mn、Zn、Cu在鐵膜中的數(shù)量大于根中和地上部,尤其Zn元素最為明顯,而在土壤培養(yǎng)條件下則又是根系中大于鐵膜中。
圖4 營養(yǎng)液和土壤培養(yǎng)方式下水稻根表、根中和地上部鋅含量Fig.4 Concentrations of Zn in root surface,roots and shoots in the hydroponics and soil culture experiments
可見,鐵膜對Cd、Mn、Cu、Zn的吸附作用,因培養(yǎng)體系和元素種類不同而有差異。土壤培養(yǎng)和營養(yǎng)液培養(yǎng)的差異在于,土壤培養(yǎng)體系中外源Fe在水稻移栽之前就施入土壤,鐵膜的形成和元素的吸收同時進行,所以鐵膜的阻擋作用并未發(fā)揮,而營養(yǎng)液培養(yǎng)體系中,水稻先形成鐵膜(在此過程營養(yǎng)液中未供應(yīng)其他元素),再在正常營養(yǎng)液中生長,所以鐵膜的作用明顯,鐵膜吸附的Mn、Zn、Cu也比根中和地上部多。實際上,許多學者的研究也證明水稻根表鐵膜在不同培養(yǎng)條件下對不同元素的吸附作用表現(xiàn)出較大的差異性。Chen等的研究結(jié)果也表明,在營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下,形成鐵膜的水稻根表Al的吸附量遠遠高于未形成鐵膜的根表,而且鐵膜中Al含量是根中含量的10倍左右[2]。Liu等也發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)液培養(yǎng)系統(tǒng)下,水稻鐵膜中As含量高于根中[28],Zhou等對Se的研究也具有同樣的規(guī)律[10]。但Deng等的研究卻發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下,鐵膜中As含量低于根中含量,根中含量在350 mg/kg左右,而鐵膜中含量則在160 270 mg/kg[29]。Liu等在土壤培養(yǎng)條件下,研究了三個不同品種水稻根表鐵膜對Pb吸收的影響,研究結(jié)果表明,Pb在根系組織中含量占78%~93%,而在鐵膜中占 6% ~21%[30]。
本試驗中,Cd、Mn、Zn、Cu在鐵膜中量并不是隨著鐵膜量的增加而增加,然而水稻根系和地上部中這些元素的含量則大多數(shù)隨著介質(zhì)中Fe濃度的增加而下降,營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下,根中和地上部Fe與Cd、Mn、Zn含量之間達到顯著性負相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為根系 rFe-Cd=0.8924,rFe-Mn=0.7158,rFe-Zn=0.5033,地 上 部 rFe-Cd=0.8119,rFe-Mn=0.5554,rFe-Zn=0.8260(n=27,0.367,P < 0.05;0.470,P<0.01)。土壤培養(yǎng)條件下,相關(guān)系數(shù)分別為根系 rFe-Cd=0.9070、rFe-Mn=0.7825、rFe-Zn=0.7800、rFe-Cu=0.8307,地上部 rFe-Cd=0.8141、rFe-Mn=0.7511(n=18,0.444,P <0.05;0.561,P <0.01),說明根系和地上部Cd、Mn、Zn含量的下降與Fe元素含量增加有密切關(guān)系,很有可能是生長介質(zhì)中的Fe2+和植株體內(nèi)的Fe降低了水稻對Cd2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+的吸收和運輸。元素之間的拮抗作用在植物吸收和運輸過程中非常普遍,有研究報道Fe2+的吸收運輸過程蛋白(ZIP和Nramp家族蛋白)也可以運輸 Mn2+、Zn2+、Cd2+等離子[31],由此推斷,介質(zhì)中的Fe2+勢必與Mn2+、Zn2+、Cd2+競爭吸收運輸系統(tǒng),抑制植物對這些元素的吸收。Cd可以干擾Zn、Fe、Mn、Cu和Ca向植物地上部的運輸[32]。本試驗中Cd也對Mn、Cu和Zn的吸收和運輸具有一定的抑制作用,也是元素之間拮抗作用的表現(xiàn),在前人的研究中也得到證明。
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