高血糖對樹鼩腦皮層局灶性缺血時海馬微環(huán)境離子穩(wěn)態(tài)及神經(jīng)元繼發(fā)性損傷的影響*

陳 靜， 李樹清

(昆明醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，云南昆明650500)

缺血性腦血管病是人類致死致殘的主要疾病之一。許多因素都可誘發(fā)或加重腦缺血的病理過程，其中，高血糖和以血糖增高為主要特征的代謝性疾病——糖尿病就是缺血性卒中的高危因素之一。高血糖可以通過多種途徑和機制對缺血后神經(jīng)元損傷發(fā)揮影響［1-2］。近年來，缺血后神經(jīng)元微環(huán)境變化與神經(jīng)元損傷的關(guān)系備受關(guān)注。神經(jīng)元微環(huán)境廣義上說，是神經(jīng)元所處的局部理化環(huán)境，包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、微循環(huán)以及主要由細(xì)胞外基質(zhì)和組織間液所構(gòu)成的細(xì)胞外間隙［3］。研究發(fā)現(xiàn)，缺血后腦損傷的一系列病理生理變化中，局部酸化是組織缺血常見的共有特征，而鈣離子超載和細(xì)胞內(nèi)水鈉潴留又是腦損害的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［4-5］。因此，神經(jīng)元微環(huán)境中酸堿平衡以及離子穩(wěn)態(tài)的維持對于缺血后神經(jīng)元的生存至關(guān)重要。本實驗選擇對缺血敏感的海馬區(qū)作為主要觀察對象，研究腦皮層局灶性缺血及高血糖條件下，離子微環(huán)境變化與海馬神經(jīng)元繼發(fā)性損傷間的相互關(guān)系，探討高血糖在缺血性腦損傷中的作用及其機制，從而為控制卒中危險因素、保護易受損神經(jīng)元提供參考。

材料和方法

1 材料

1．1 動物與分組 健康成年樹鼩40只，雌雄不拘，體重(120±20)g(由昆明醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)。隨機分為正常血糖(normoglycemia，NG)和高血糖(hyperglycemia，HG)2個大組，每個大組又隨機分為假手術(shù)組、缺血4 h、缺血24 h及缺血72 h 4個亞組，即有:正常血糖假手術(shù)組(NG-sham)、缺血(ischemia，Is)4 h組(Is4)、缺血24 h組(Is24)、缺血72 h組(Is72)、高血糖假手術(shù)組(HG-sham)、HG+Is4組、HG+Is24組和HG+Is72組，共8個亞組。每個亞組均為5只動物。安靜、避光、相同條件下飼養(yǎng)。

1．2 試劑 鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)，Sigma產(chǎn)品;孟加拉紅(rose bengal)，F(xiàn)luka產(chǎn)品，以0．85%生理鹽水溶解，濃度為15 g/L;林格氏液，四川科倫藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，臨用前調(diào)定pH值至7．4使用。

1．3 器材 SQ-Ⅲ型光化學(xué)誘導(dǎo)腦血栓形成裝置(本室研制);隨手測血糖儀及血糖試紙(LifeScan產(chǎn)品);單泵等速推挽式微灌流系統(tǒng)(本室研制);KW-Ⅱ型腦立體定位儀(西北光學(xué)儀器廠產(chǎn)品);DH-505型K+/Na+/Cl－/Ca2+/pH電解質(zhì)分析儀(南京安科電子醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn));PHS-2C精密酸度計(上海雷磁儀器廠生產(chǎn))。

2 方法

2．1 STZ誘導(dǎo)樹鼩實驗性高血糖模型的制備［6］樹鼩禁食12 h，不禁水，采集手掌末梢血測定空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)。高血糖組腹腔1次性注射新鮮配制的 STZ溶液(STZ臨用前以0．1 mol/L、pH 4．2的無菌檸檬酸鹽緩沖液溶解配制成2%STZ溶液)，劑量為120 mg/kg;正常血糖組僅腹腔注射同等劑量的緩沖液。所有動物給予同樣標(biāo)準(zhǔn)的飼料和充足的水分，給藥3 d以后再次采血測定FBG，將FBG≥11．1 mmol/L者列為高血糖組實驗對象。

2．2 樹鼩皮層血栓性腦缺血模型的建立［7］以1%硫噴妥鈉溶液，按5 mL/kg腹腔注射麻醉樹鼩，俯臥位固定。于右側(cè)顳頂部作約1．5 cm長的弧形切口，分離皮下組織，暴露顱骨。于切口處皮下嵌入一外徑2．5 cm、中心處有直徑0．5 cm圓孔的消毒鋁片，鋁片周圍用避光紙遮蓋保護。至此，經(jīng)舌下靜脈一次性注射孟加拉紅生理鹽水溶液1．33 mL/kg，循環(huán)10 min后，將動物置于SQ-Ⅲ型光化學(xué)誘導(dǎo)腦血栓形成裝置下，在光強度1．0 W/cm2下照射15 min，照射期間顱骨表面溫度維持在(36．5±1.0)℃左右。照畢，取出鋁片、縫合切口、保溫待動物清醒后放回飼養(yǎng)籠內(nèi)觀察。假手術(shù)組也按規(guī)定劑量注射孟加拉紅而不予光照。

2．3 樹鼩海馬微灌流及離子微環(huán)境檢測 實驗組分別于光化學(xué)反應(yīng)后4、24及72 h，假手術(shù)組于光化學(xué)反應(yīng)后24 h時點，提前1．5 h麻醉動物，固定在立體定位儀上。以法蘭克福平面(Frankfurt plane)作為立體定位坐標(biāo)系統(tǒng)的基礎(chǔ)，這一平面通過外耳道的中心以及眶口的下緣，冠狀面與法蘭克福平面垂直并同時通過兩外耳道的中心，形成AP 0．0平面［8］。選擇右側(cè)海馬為灌流部位，以AP 0．0平面前2．5 mm(A 2．5)、中線右側(cè)6．5 mm(R 6．5)坐標(biāo)點處為穿刺點，在顱骨上鉆直徑為1 mm的小孔，勿破壞硬腦膜。以電極固定器夾持微灌流探針，在數(shù)字式微電極驅(qū)動器控制下，自硬腦膜表面向下垂直進針8.0 mm(H 8．0)至海馬，置入微灌流探針后，用單泵等速推挽式微灌流系統(tǒng)以林格氏液為灌流液，按10μL/min的灌流速度分別對各組動物行海馬微灌流，維持灌流液溫度為37℃，平衡預(yù)灌流60 min后，收集灌流液標(biāo)本0．5 mL，避免與空氣接觸。所得標(biāo)本立即用離子分析儀進行 Na+、K+、Ca2+、Cl－含量及 pH 值分析。

2．4 腦組織形態(tài)學(xué)觀察

2．4．1 腦組織固定與取材 動物仰臥位固定，暴露心臟，鉗閉降主動脈，直視下將灌注管經(jīng)左心室進入升主動脈。剪開右心耳，先用4℃的0．85%生理鹽水100 mL沖洗，再用4℃的10%中性緩沖甲醛200 mL灌流固定，動物僵直為滿意。取出整腦，用10%中性緩沖甲醛后固定48～72 h。冠狀切取視交叉后1～4 mm的腦組織，常規(guī)脫水、石蠟包埋，由前向后連續(xù)行冠狀切片，片厚4μm。

2．4．2 HE染色 將石蠟切片脫蠟至水，HE染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片后顯微鏡觀察。

2．4．3 形態(tài)學(xué)分析 顯微鏡下觀察缺血側(cè)大腦皮層缺血中心區(qū)和半暗帶的形態(tài)學(xué)改變。同時，選擇對缺血敏感的海馬CA1區(qū)進行腦損傷定量評價。(1)組織學(xué)分級:在光學(xué)顯微鏡下以相同光亮度對海馬CA1區(qū)組織學(xué)改變進行分級，標(biāo)準(zhǔn)如下:0級，無神經(jīng)元死亡;Ⅰ級，散在的神經(jīng)元死亡;Ⅱ級，成片的神經(jīng)元死亡;Ⅲ級，神經(jīng)元幾乎全部死亡。(2)存活神經(jīng)元計數(shù):因海馬CA1區(qū)呈帶狀分布，且為了排除壞死、凋亡及各種變性細(xì)胞的區(qū)別所造成的影響，所以只計數(shù)正常的存活細(xì)胞數(shù)，即用微計數(shù)尺在20倍物鏡下計數(shù)患側(cè)海馬CA1區(qū)每毫米的存活神經(jīng)元數(shù)，每張切片計數(shù)3個區(qū)段，取其平均數(shù)為神經(jīng)元密度(neuronal density，ND)，作為評價缺血損害的指標(biāo)。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 11．5統(tǒng)計軟件包，行正態(tài)性檢驗t檢驗、方差齊性檢驗、One-way方差分析以及樣本均數(shù)間的兩兩比較(LSD法)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 給予STZ前后樹鼩血糖水平的變化

腹腔注射緩沖液的樹鼩，血糖水平在給藥前后無明顯差異;而腹腔注射120 mg/kgSTZ，能使樹鼩血糖水平顯著升高(P＜0.01)，制備出符合要求的實驗性高血糖動物模型，見表1。

表1 樹鼩空腹血糖的變化Table 1．The changes of fasting blood glucose in tree shrews(mmol/L．Mean±SD．n=20)

2 腦缺血及高血糖腦缺血條件下海馬離子微環(huán)境的變化

缺血組動物缺血后各時點pH值與假手術(shù)組相比均有下降，以缺血后4 h最為顯著(P＜0．01)，其次為缺血后24 h(P＜0.05);K+含量在缺血后4 h明顯升高(P＜0.01)，其余時點的變化與假手術(shù)組相比無顯著差異;Na+在缺血后4 h(P＜0．01)和24 h(P＜0．05)明顯下降;Ca2+在缺血后4 h降低(P＜0.01);Cl－同樣也在缺血后 4 h降低(P ＜0．05)，其余時點無明顯變化。單純高血糖組樹鼩，海馬微環(huán)境中 pH 值、K+、Na+、Ca2+和 Cl－的含量與正常血糖假手術(shù)組相比均無明顯差異(P＞0．05)。高血糖加缺血組動物缺血后各時點pH值、K+、Na+、Ca2+和Cl－含量的變化規(guī)律與正常血糖缺血組相似:K+含量在缺血72 h后也有升高(P＜0．05);Ca2+含量在缺血24 h后依然降低(P＜0．05);Cl－在缺血后的各時點均未見明顯變化(P＞0．05)。缺血后4 h，高血糖組pH值、K+和Ca2+含量比正常血糖組變化更為明顯(P＜0．05);而缺血后24 h，高血糖組的 pH值及Na+含量與正常血糖組同期值相比，下降也更為顯著(P ＜0．05)，見表2。

3 腦缺血及高血糖腦缺血條件下的腦組織形態(tài)學(xué)分析

HE染色顯示，NG-sham組皮層結(jié)構(gòu)完整，海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，錐體細(xì)胞排列緊密整齊，見圖1A。光化學(xué)反應(yīng)后4 h即可見缺血性損傷改變。24 h病變尤為明顯，皮層缺血中心區(qū)液化、壞死，神經(jīng)元脫失;半暗帶皮質(zhì)水腫，神經(jīng)元腫脹、固縮;海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞稀疏、排列散亂、出現(xiàn)典型的缺血損傷性改變，胞體縮小呈三角形、胞核固縮深染、核仁消失，見圖1B。缺血后72 h，仍可見到缺血固縮的神經(jīng)元，并伴隨膠質(zhì)細(xì)胞增生等修復(fù)性反應(yīng)。HG-sham組樹鼩皮層及海馬存在散在的細(xì)胞損傷性改變，細(xì)胞周圍空暈形成，胞質(zhì)濃染，胞體變小，見圖1C。HG+Is組各時點組織學(xué)特征與Is組相似，但損傷情況更為嚴(yán)重，皮層出現(xiàn)較大液化灶，海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層次不清，成片死亡，見圖1D。

從各組動物患側(cè)海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級中可以發(fā)現(xiàn)，光化學(xué)誘導(dǎo)樹鼩腦皮層缺血后4 h，在同側(cè)海馬區(qū)也檢測到了海馬神經(jīng)元的繼發(fā)性損傷，24 h達高峰，72 h損傷仍很明顯;高血糖本身也會引起神經(jīng)細(xì)胞損傷;高血糖加缺血組在各時點的CA1區(qū)組織學(xué)分級更高，海馬神經(jīng)元繼發(fā)性損傷更為嚴(yán)重，見表3。

海馬CA1區(qū)存活神經(jīng)元計數(shù)顯示，NG-sham組ND 為188．00±15．95;Is組 ND 下降，缺血后4 h、24 h和72 h 的 ND 分別為 106．60 ±19．81、78．40 ±15.31和95．80±13．01，與 NG-sham 組相比，均 P ＜0．01;升高血糖也會引起神經(jīng)元損傷，HG-sham組ND為 160．40 ±18．41，與 NG-sham 組相比，P ＜0.05;HG+Is組的缺血性損傷加重，在缺血后4 h、24 h和72 h 的 ND 值分別為 92．80 ±20．10、42．00 ±17．29 和72．20 ±17．91，與 Is組的同期值相比，在缺血后24 h和72 h差異尤為明顯(P＜0．05)，見圖2。

Figure 1．The effects of focal cortical ischemia and hyperglycemia on the histomorphology of the ipsilateral hippocampus in tree shrews(HE staining，×200)．A:normoglycemia(NG)-sham group;B:24 h after ischemia in NG group;C:hyperglycemia(HG)-sham group;D:24 h after ischemia in HG group．圖1 腦皮層局灶性缺血及高血糖對樹鼩同側(cè)海馬組織形態(tài)學(xué)的影響

表3 樹鼩腦皮層缺血后患側(cè)海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級的變化Table 3．Changes in the histological grades of the ipsilateral hippocampal CA1 area after cortical ischemia in tree shrews(n=5)

Figure 2．Changes of the intact pyramidal neuronal density(ND)in the hippocampal CA1 area after cortical ischemia in tree shrews．NG:normoglycemia;HG:hyperglycemia;Is4，Is24 and Is72:4，24 and 72 h after ischemia，respectively．Mean ± SD．n=5．*P ＜0.05，＊＊P ＜0．01 vs sham;△P ＜ 0．05，△△P ＜ 0．01 vs NG．圖2 樹鼩腦皮層缺血后患側(cè)海馬CA1區(qū)存活神經(jīng)元密度的變化

討 論

神經(jīng)元是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，其生活在特定的微環(huán)境中;神經(jīng)元微環(huán)境是一個成分多樣、組成復(fù)雜的細(xì)胞生存空間。對神經(jīng)元微環(huán)境的探討是近年來神經(jīng)科學(xué)研究的熱點之一。在微環(huán)境的組成中，細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外間隙以及細(xì)胞外間隙的不同要素之間均存在密切的相互作用和制約，這種復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系發(fā)揮著微妙而精細(xì)的調(diào)節(jié)功能，促成神經(jīng)元微環(huán)境性質(zhì)的穩(wěn)定。缺血、缺氧、pH值、酸堿、血糖水平等的改變，均可引起微環(huán)境的改變，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死的發(fā)生。

本實驗利用光化學(xué)方法誘導(dǎo)血栓形成，從而在樹鼩右側(cè)頂葉皮層復(fù)制出局灶性腦缺血模型。我們不僅可以在缺血側(cè)皮層觀察到明顯的梗死灶，而且在患側(cè)海馬也檢測到神經(jīng)元的繼發(fā)性損傷及其離子微環(huán)境(細(xì)胞外 pH 值、K+、Na+、Ca2+、Cl－)的顯著改變。同時，微環(huán)境內(nèi)酸堿平衡以及離子穩(wěn)態(tài)性的破壞恰恰也就為組織形態(tài)學(xué)結(jié)果提供了合理解釋及有力證明，我們認(rèn)為海馬離子微環(huán)境的改變可能是造成海馬細(xì)胞繼發(fā)性損傷的重要原因。那么，皮層缺血為什么會引起海馬微環(huán)境的紊亂呢?研究顯示，海馬神經(jīng)元對腦缺血非常敏感、具有高度選擇性易受損的特點［9］;并且，由于海馬組織與腦皮層及側(cè)腦室位置相毗鄰;其傳入纖維豐富、與周圍組織密切聯(lián)系，這就使得海馬細(xì)胞微環(huán)境易于受到缺血中心區(qū)的影響。因此，我們推測，海馬微環(huán)境的改變與皮層缺血中心區(qū)有關(guān)，可能是皮層缺血區(qū)缺血微環(huán)境惡化并向周圍擴散的結(jié)果。海馬微環(huán)境受損的機制可能涉及以下幾方面:(1)缺血區(qū)去極化及皮層擴布性抑制(spreading depression，SD)。缺血區(qū)去極化是由梗塞中心缺氧性K+釋放及缺氧性谷氨酸釋放所觸發(fā)的。而SD是指大腦皮層神經(jīng)元在持續(xù)有害刺激下，出現(xiàn)的一種伴有細(xì)胞膜去極化的、緩慢、擴布性的、短暫、可逆的皮層電生理活動的抑制［10］。SD是一種短暫的離子波，包括有K+的釋放和Ca2+、Na+及Cl－的吸收［11］。本研究中離子微環(huán)境的變化趨勢也與之相符合。由于離子濃度的變化，導(dǎo)致興奮性氨基酸釋放增加，引起梗塞灶周圍出現(xiàn)重復(fù)的病理性SD，使缺血性損害加大。因而我們推測海馬神經(jīng)元離子微環(huán)境平衡的破壞可能是SD的特殊表現(xiàn)之一。(2)海馬微環(huán)境的改變與海馬區(qū)血管受損及血流動力學(xué)異常有關(guān)。本實驗中，腦缺血的形成是以光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生單線態(tài)氧，使照射部位血管內(nèi)皮細(xì)胞受損作為始發(fā)因素的。血管內(nèi)皮細(xì)胞受損后可進一步激活凝血因子、內(nèi)源性血小板活化因子產(chǎn)生增加、釋放大量的活性氧、自由基及炎癥介質(zhì)等。這些異常增多的血管活性物質(zhì)不僅可以引起光照局部血栓形成，發(fā)生缺血梗死;而且它們尚可通過血液循環(huán)、細(xì)胞外間隙、神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系等途徑轉(zhuǎn)移、擴散至其它區(qū)域，如與之毗鄰且對缺血易感的海馬，進而使海馬區(qū)血管受損和血小板活化，誘導(dǎo)血栓形成，從而直接造成海馬區(qū)缺血微環(huán)境的形成。形態(tài)學(xué)檢查中，我們在缺血側(cè)海馬區(qū)小血管可見到微血栓的形成，就給予上述推測以有力支持。

在本研究中，高血糖不僅是缺血性腦血管病的危險因素之一，也是缺血性腦損傷的惡化因素。與正常血糖缺血組同期值相比，高血糖加缺血組動物的損傷程度和范圍均有所加重，皮層梗死灶更大，海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級更高、存活神經(jīng)元密度更低;而這又與高血糖加重細(xì)胞外酸中毒、加劇缺血微環(huán)境的紊亂密切相關(guān)。光化學(xué)誘導(dǎo)皮層腦缺血后引起海馬細(xì)胞微環(huán)境內(nèi)pH值的降低，變化以缺血后4 h最顯著，而高血糖組在缺血后4及24 h時，細(xì)胞外液pH值下降程度則更為明顯。這是因為腦缺血時葡萄糖無氧酵解加速，乳酸生成增多，且此時能量匱乏，膜轉(zhuǎn)運功能失常，對酸堿平衡進行緩沖和調(diào)節(jié)的能力亦降低，致使細(xì)胞內(nèi)外pH下降。而高血糖狀態(tài)增加了底物的供給，乳酸大量堆積，加之缺血組織腦循環(huán)受阻，使乳酸積累到更高水平，從而加重酸中毒。同時，在高血糖狀態(tài)下，由于嚴(yán)重的酸中毒及能量匱乏等原因，使細(xì)胞膜通透性增加及離子泵活性降低，進一步增加了 Na+、Ca2+內(nèi)流和 K+的外流。此外，高血糖也抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活化［12］。星形膠質(zhì)細(xì)胞富含糖元，其pH值下降程度比其它細(xì)胞更重，更易發(fā)生變性、壞死，從而喪失對神經(jīng)細(xì)胞的營養(yǎng)支持作用，也喪失對細(xì)胞外液離子穩(wěn)態(tài)性的調(diào)節(jié)能力，更加重了細(xì)胞內(nèi)鈣超載和鈉水潴留。而能量代謝的變化以及微環(huán)境離子穩(wěn)態(tài)性的紊亂可進一步通過加速自由基的產(chǎn)生，增強興奮性氨基酸的毒性作用，干擾細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)合成等分子機制，激發(fā)引起細(xì)胞快速死亡的級聯(lián)反應(yīng)，造成腦細(xì)胞的繼發(fā)性損傷。由此可見，海馬微環(huán)境的改變可能是造成海馬神經(jīng)元繼發(fā)性損傷的重要原因之一，高血糖加重缺血性腦損傷的作用與其加劇缺血微環(huán)境的紊亂互為因果，形成惡性循環(huán)，從而使得對正常血糖者而言是可逆性的時間窗對高血糖或糖尿病患者而言變得不可逆。