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    新生SD大鼠血常規(guī)各項與發(fā)育時間的相關(guān)性分析及其與血清鐵濃度變化的機制*

    2013-12-01 02:29:26徐開宇杜興華王偉舟李俊宏周發(fā)勇
    中國病理生理雜志 2013年12期
    關(guān)鍵詞:血常規(guī)新生計數(shù)

    徐開宇, 杜興華, 王偉舟, 崔 鑫, 李俊宏, 周發(fā)勇, 譚 龍, 王 輝, 李 凡

    (昆明醫(yī)科大學(xué)1臨床醫(yī)學(xué)專業(yè),3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系,云南昆明650500;2云南省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗科,云南昆明650224)

    新生兒疾病嚴重威脅著社會的發(fā)展與進步,建立模擬臨床新生兒疾病的動物模型,對研究新生兒疾病的發(fā)病機制具有較強的現(xiàn)實意義。SD大鼠作為重要的實驗動物,其血常規(guī)是重要且常用的實驗基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。然而,現(xiàn)有關(guān)SD大鼠血液學(xué)指標及生化指標正常參考值范圍的研究報道均為2周齡以上大鼠[1],而用于模擬新生兒疾病的新生SD大鼠,其血常規(guī)指標的研究尚無報道。目前的研究多采用經(jīng)心臟或靜脈血管穿刺獲取大鼠血液樣本。然而新生鼠體重輕、體積小,直接經(jīng)靜脈血管采血無法實現(xiàn),因此,本研究擬通過心臟穿刺和剪斷鼠尾2種方法采集血液,并進一步研究這2種方式對血常規(guī)的影響。紅細胞(red blood cells,RBC)是維持血液功能的重要組份,由于其高攜氧性,其膜在病理情況下易受過氧化損傷,進而導(dǎo)致胞漿內(nèi)鐵釋放。目前,RBC損傷[2]及其損傷后鐵代謝紊亂[3]在多種新生兒疾病發(fā)生過程中的作用備受研究者關(guān)注,但機制不清。有關(guān)正常新生SD大鼠血清鐵(serum iron,SI)和RBC相關(guān)性的研究尚未見報道。據(jù)此,本實驗探討新生鼠經(jīng)心臟穿刺和剪斷鼠尾2種不同采血方法對血常規(guī)數(shù)據(jù)的影響;研究新生鼠不同發(fā)育階段血細胞形態(tài)、血常規(guī)和SI的動態(tài)變化,及其與發(fā)育時間的關(guān)系;揭示SI與血常規(guī)各項,尤其是與RBC計數(shù)及其形態(tài)改變間的相關(guān)關(guān)系,從而建立新生SD大鼠不同發(fā)育階段的血常規(guī)參考值范圍,揭示新生SD大鼠發(fā)育過程中血液可能存在的特殊性,及其與SI之間可能存在的相關(guān)性,為新生兒疾病的動物實驗研究以及經(jīng)外周血液解釋新生兒疾病的發(fā)生機理提供重要的實驗室依據(jù)。

    材料和方法

    1 動物

    SPF級新生SD大鼠25窩,每窩10只(雌雄不拘),共250 只,體重 6.0 ~8.0 g,母鼠喂養(yǎng),由昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

    2 儀器及方法

    2.1 采集心臟血 新生鼠,于出生后(postnatal,P)1、2、3、7 和 14 d,經(jīng)腹腔注射 3% 戊巴比妥鈉(1.3 μL/g)麻醉后,采用1 mL注射器行右心室穿刺取血(不再進行鼠尾采血)。其中30%(≥60μL)置于枸櫞酸鈉抗凝管中,作為檢測血常規(guī)之用;其余70%(≥140μL)經(jīng)肝素鈉抗凝后,室溫下3 000 r/min離心5 min,取上清液作為檢測SI之用。

    2.2 采集鼠尾血 于相應(yīng)時點(未進行過心臟采血的新生鼠),鼠尾經(jīng)75%乙醇消毒后剪斷尾尖,輕微擠壓尾根,使用一次性玻璃毛細吸管快速采集尾尖流出的血液(≥60μL),置于枸櫞酸鈉抗凝管中,輕彈管壁使血液與抗凝劑充分混勻。

    2.3 檢測血常規(guī) 所采集各時點新生鼠心臟血和鼠尾血,經(jīng)全自動血液分析儀(Sysmex XS-800i)檢測其RBC、血紅蛋白(hemoglobin,HGB)、紅細胞壓積(hematocrit,HCT)、紅細胞平均體積(mean corpuscular volume,MCV)、平均血紅蛋白量(mean corpuscular hemoglobin,MCH)、平均血紅蛋白濃度(mean corpuscular hemoglobin concentration,MCHC)、血小板(platelets,PLT)和白細胞(white blood cells,WBC)的改變。

    2.4 血細胞形態(tài)學(xué)觀測 所采集各時點新生鼠心臟血和鼠尾血,枸櫞酸鈉抗凝后,進行血涂片,滴加瑞氏-姬姆薩A液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司),約0.6 mL,讓染液覆蓋整個涂片,染色1 min后滴加約1.5 mL瑞氏-姬姆薩B液于A液上,使用洗耳球?qū)梢撼浞只旌希旧? min,自來水沖洗玻片,干燥后置于生物顯微鏡(Nikon Eclipse 50i)100倍鏡下觀察血細胞形態(tài)學(xué)特征,并經(jīng)高解析數(shù)位顯微鏡相機(Nikon DXM1200C)進行拍攝。

    2.5 SI含量測定 肝素鈉抗凝、離心后的各時點心臟血血清經(jīng)生化分析儀(Olympus AU2700)檢測血清中鐵含量的變化。

    3 統(tǒng)計學(xué)處理

    使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理。若數(shù)據(jù)呈現(xiàn)正態(tài)分布,且各組間方差齊,則進一步采用 One-way ANOVA進行分析;若呈非正態(tài)分布或各組間方差不齊,則采用非參數(shù)的Mann-Whitney檢驗和Kruskal-Wallis檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。在進行相關(guān)性分析前,首先對各目標數(shù)據(jù)與發(fā)育時間進行Spearman相關(guān)分析,若目標數(shù)據(jù)與時間呈線性相關(guān),則進一步對各數(shù)據(jù)進行兩兩Pearson相關(guān)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)或中位數(shù)±四分位數(shù)間距(median±Q)表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 心臟血與鼠尾血對比

    鼠尾血RBC計數(shù)在 P1d(P<0.01)、P2d(P<0.01)和P14d(P<0.05)明顯高于心臟血,見圖1A;鼠尾血HGB含量和WBC計數(shù)在各時點均高于心臟血(P <0.01),見圖 1B、D;值得注意的是,鼠尾血PLT計數(shù)在P2d~P7d時與心臟血無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05),而在 P1d時高于心臟血(P <0.05),在P14d時卻明顯低于心臟血(P<0.01),見圖1C。

    Figure 1.Changing tendencies of RBC(A),HGB(B),PLT(C)and WBC(D)from the cardiac or tail blood at different developmental stages.Mean ± SD.n=25.*P <0.05,**P <0.01 vs cardiac blood.圖1 新生鼠不同發(fā)育階段心臟血與鼠尾血RBC、HGB、PLT和WBC計數(shù)的變化趨勢

    2 心臟血與鼠尾血涂片瑞氏-姬姆薩染色結(jié)果

    鼠尾血涂片中RBC形態(tài)結(jié)構(gòu)差異較大,出現(xiàn)了口型紅細胞等異形RBC(釘頭所指),且RBC的碎片(箭頭所指)明顯多于心臟血;心臟血中RBC形態(tài)結(jié)構(gòu)整齊,異形RBC比例明顯少于鼠尾血;鼠尾血涂片中亦可見較多PLT;WBC形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯差異,見圖2。

    Figure 2.Blood smears from the heart or tail blood in the normal neonatal SD rats at different developmental stages(Wright-Giemsa staining,×400).The results showed that there were more stomatocytes(black arrowheads)in the blood of P1d~P3d,and more poikilocytes and fragments(black arrows)appeared in the tail blood than in the heart blood.The deeply stained elements between the RBC were blood platelets.The hollow arrows showed the WBC.圖2 新生鼠不同發(fā)育階段心臟血和鼠尾血涂片瑞氏-姬姆薩染色結(jié)果

    3 心臟血血常規(guī)結(jié)果

    3.1 發(fā)育過程中RBC及其相關(guān)指標的動態(tài)變化 新生鼠 RBC計數(shù)從 P2d開始增多,P7d時與 P1d(P <0.01)、P2d(P <0.01)、P3d(P <0.05)已有顯著差異,之后P14d較P7d時亦有明顯增多(P<0.01);HGB含量、HCT、MCV、MCH 和MCHC從 P2d開始降低,其中P2d時HGB 含量(P<0.05)、MCH(P<0.01)和MCHC(P<0.01)明顯低于P1d;MCV于P3d時低于P1d(P<0.01);HCT于P7d、P14d時顯著低于P1d(P <0.01),見表1。

    3.2 發(fā)育過程中PLT計數(shù)變化 PLT計數(shù)于P3d時最少,之后開始增加,P7d時明顯多于P3d(P<0.01),P14d進一步增加,顯著高于P7d(P<0.01),見表1。

    3.3 發(fā)育過程中WBC計數(shù)變化 WBC計數(shù)在P1d最多,之后開始減少,P2d較P1d、P7d較P3d時均有明顯減少(P<0.05),P7d開始趨于穩(wěn)定,P7d與P14d已無顯著差異(P>0.05),見表1。

    4 不同發(fā)育階段心臟血涂片染色結(jié)果

    P1d~P3d時RBC大小不等,染色較淺,中心淺染區(qū)較大,有較多口型紅細胞出現(xiàn)(釘頭1所指),并可見灰藍色的嗜多色性幼稚RBC(釘頭2所指)及網(wǎng)織RBC(未示出);P3d時,RBC中心淺染區(qū)縮小,染色變深,仍可見RBC殘片(箭頭1所指);P7d-P14d,RBC分布均勻,形態(tài)相似,染區(qū)逐漸縮小至穩(wěn)定大小,雙凹圓盤狀明顯,未見幼稚細胞,WBC形態(tài)未見明顯變化(空心箭頭所指),見圖2。

    5 發(fā)育過程中SI含量的動態(tài)變化

    P1d時 SI含量為(26.13 ±9.09)mg/L,P2d增加至(31.35 ±7.95)mg/L,P3d 降低至(29.57 ±8.67)mg/L,但各組間SI含量無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);P7d時SI含量進一步下降,其值為(21.46±6.99)mg/L,較P3d有顯著差異(P<0.01);P14d時 SI含量降至(11.56±4.45)mg/L,與 P7d差異顯著(P <0.01),見圖 3。

    6 各指標間的相關(guān)性分析

    6.1 發(fā)育時間與血常規(guī)各項指標及SI的相關(guān)性分析

    6.1.1 RBC計數(shù)及其相關(guān)指標與發(fā)育時間的相關(guān)性分析 RBC計數(shù)與時間呈顯著正相關(guān)(P<0.01),即 RBC計數(shù)隨時間延長有增多的趨勢。HGB 含量、HCT、MCV、MCH、MCHC 與發(fā)育時間則呈顯著負相關(guān)(P<0.01),即 HGB 含量、HCT、MCV、MCH和MCHC隨時間延長有減少的趨勢,見表2。

    6.1.2 PLT計數(shù)與發(fā)育時間的相關(guān)性分析 PLT計數(shù)與發(fā)育時間呈顯著正相關(guān)(P<0.01),即PLT計數(shù)隨時間延長有增多的趨勢,見表2。

    表1 正常SD大鼠出生后不同年齡組心臟血血常規(guī)指標參考范圍Table 1.Normal reference range of routine blood examination indexes from the heart in different age groups

    Figure 3.SI concentration in cardiac blood at different developmental stages in neonatal rats.Mean ± SD.n=16.△△P <0.01 vs 3 d;**P <0.01 vs7 d.圖3 正常SD大鼠出生后不同年齡組心臟血血清鐵含量

    6.1.3 WBC計數(shù)與發(fā)育時間的相關(guān)性分析 WBC計數(shù)與發(fā)育時間顯著負相關(guān)(P<0.01),即WBC計數(shù)隨時間延長有減少的趨勢,見表2。

    6.2 SI含量與發(fā)育時間的相關(guān)性分析 SI含量與發(fā)育時間呈顯著負相關(guān)(P<0.01),即新生鼠出生后,SI含量隨時間延長有降低的趨勢,見表2。

    6.3 SI與血常規(guī)各指標間相關(guān)性分析 SI含量與RBC計數(shù)呈負相關(guān)(P<0.05),也就是隨著RBC計數(shù)的逐漸增多,SI含量有減少的趨勢;SI含量與MCV(P <0.01)和 MCH(P <0.05)則呈正相關(guān),也就是隨SI含量的減少,MCV和MCH也逐漸降低;而SI含量與其它檢測項目相關(guān)性不明顯,見表3。

    表2 SI及血常規(guī)各項與發(fā)育時間的相關(guān)性Table 2.Correlation between developmental stage with blood indexes and SI in cardiac blood from neonatal SD rats(n=80)

    表3 新生鼠心臟血血常規(guī)各項與SI含量的相關(guān)性Table 3.Correlation between SI with blood indexes in cardiac blood from neonatal SD rats(n=80)

    討 論

    由于新生兒疾病的遠期并發(fā)癥所造成的嚴重社會問題,新生兒的健康日益受到社會各界的廣泛關(guān)注。血液是臨床上新生兒最容易獲取的體液標本,它為監(jiān)測新生兒在生理及病理情況下的體內(nèi)環(huán)境提供了最為直接的信號。SD大鼠等嚙齒類動物因其繁殖速度快、價格低廉,而被廣泛運用于實驗研究中。然而,實驗動物不同部位的血液具有不同的流動特性,這導(dǎo)致同一動物采用不同的采血方法將出現(xiàn)檢測結(jié)果不一致的情況。在實驗過程中,新生鼠因其體積小,無法直接經(jīng)靜脈血管采血。故嘗試經(jīng)右心室和鼠尾分別采集心臟靜脈血和末梢血,比較分析2種方法所得RBC、HGB、PLT和WBC的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)新生鼠鼠尾血的RBC、HGB和WBC值均高于心臟血。同時,有臨床研究表明新生兒足跟末梢血中 RBC、HGB、WBC 等參數(shù)均高于股靜脈血[4],這與本研究結(jié)果相似。一方面,因為鼠尾血屬于末梢血,在末梢血管的動脈端,血漿流體靜壓比血漿滲透壓大,從而血液向外濾出,血液被濃縮;另一方面,由于二者血管口徑大小不同,其血液流變特性也不同。血液在較大的靜脈血管中,呈一般的流體特性;在微血管中,由于“RBC徑向遷移”現(xiàn)象,使靠近管壁處形成一層沒有細胞的懸浮流體層即無細胞層[5],在微血管軸心處血細胞聚集流動,而采血時常取到血管軸心處也就是血細胞密度較大的部分,導(dǎo)致鼠尾血血液學(xué)指標高于心臟血。另外,鼠尾血中較多的口形、異形RBC及其碎片提示,新生鼠出生后早期,RBC自身穩(wěn)定性差,脆性高,易發(fā)生形變。斷尾采血時擠壓尾部,外力使幼稚的RBC發(fā)生變形,推片過程中,也更容易導(dǎo)致RBC變形甚至破裂。

    目前的研究認為,新生SD大鼠的大腦在出生后完成類似于人類孕期直到出生后足月的發(fā)育過程。其P1d、P2d和P3d分別相當于孕齡18~20周、20~24周和24~28周出生的可存活早產(chǎn)兒[6]。P10d左右的新生鼠則相當于足月兒(32~36周)[7]。因此,P1d~P3d的新生鼠常用于模擬妊娠中晚期易患的新生兒疾?。?]。現(xiàn)雖有實驗室對成年SD大鼠的血常規(guī)等進行了相應(yīng)的研究[9],但關(guān)于新生鼠血常規(guī)的研究,目前未見報道。此外,現(xiàn)雖已知新生兒由于宮內(nèi)外的差異,其與RBC相關(guān)的血常規(guī)指標均高于正常成年人,然而對于模擬人類新生兒疾病的新生SD大鼠來說,其血液學(xué)指標的改變是否與人類相同?尚不明確。因此,建立和完善新生鼠血液學(xué)指標,將有助于使用該發(fā)育階段的動物,建立相關(guān)疾病動物模型,為研究新生兒疾病的發(fā)病機理提供新的實驗依據(jù)。

    RBC是血液中參與攜氧的細胞,其功能直接影響到個體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。目前的研究認為在新生兒缺血缺氧性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)等新生兒疾病中,促紅細胞生成素能夠改善缺血[2]、缺氧[10]所造成的 HIE 腦部病理損傷,但 RBCs在HIE發(fā)生中的病理生理學(xué)機制有待進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn),SD大鼠P1d~P14d過程中,RBCs計數(shù)逐漸增多,與發(fā)育時間呈現(xiàn)正相關(guān)。形態(tài)學(xué)結(jié)果提示,新生鼠P1d~P3d期間,RBC體積較大,形態(tài)不整,口形、異形、嗜多色性的RBC及其碎片較P7d之后要多,說明該階段骨髓造RBC功能活躍,外周RBC尚未完全成熟,脆性大并處于溶血狀態(tài),進而導(dǎo)致RBC內(nèi)的鐵釋放入血,使得SI含量升高;同時未成熟RBC內(nèi)HGB含量較高,因此該發(fā)育時期HGB含量高于P7d;HCT為血液中紅細胞所占容積的比例,P1d~P3d時,雖然RBC計數(shù)較P7d少,但因體積大,使該階段HCT值高于P7d;MCV=HCT/RBC×100%,因該階段HCT高而RBC計數(shù)少,因此,該時點MCV高于P7d及其后的時點;MCH和MCHC均與RBC計數(shù)有關(guān),我們的研究結(jié)果表明該發(fā)育階段RBC計數(shù)較少,因此這2個值的水平均較高。介于該發(fā)育階段RBC的不成熟性,以及SI含量高的現(xiàn)象,為我們進一步研究RBC及鐵代謝紊亂在新生兒疾病發(fā)生發(fā)展中的機制提供了重要參考價值。

    本研究結(jié)果顯示,血液中PLT計數(shù)與新生鼠發(fā)育時間呈現(xiàn)正相關(guān),隨著發(fā)育時間延長PLT增多,這從另一個方面提示新生鼠凝血功能經(jīng)歷了逐步完善的過程。P7d之前新生鼠血液系統(tǒng)還未完善,凝血功能較差,之后凝血功能逐步完善,在經(jīng)鼠尾采血過程對鼠尾的擠壓,激活凝血因子,造成微凝血塊和PLT聚集,從而使得P14d鼠尾血液中PLT計數(shù)顯著低于心臟血。

    P1d~P14d的過程中,血液中WBC計數(shù)隨發(fā)育時間推移逐漸減少,與發(fā)育時間呈現(xiàn)顯著負相關(guān),但在這一過程中WBC形態(tài)未發(fā)生明顯變化??梢?,在新生動物發(fā)育早期,血液中WBC計數(shù)明顯高于個體發(fā)育成熟之后。目前的研究認為,腦內(nèi)部分小膠質(zhì)細胞來源于外周單核細胞,與外周血液中WBC關(guān)系密切[11],分享多種基因表型[12],具有較強的同源性。最近有學(xué)者經(jīng)電鏡證實新生鼠腦內(nèi)基膜并不完整,且密度低[13];另有研究對比新生鼠和成年鼠血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)的發(fā)育情況[14],發(fā)現(xiàn)新生鼠出生后早期BBB發(fā)育并不完善,可使小分子物質(zhì)易于透過BBB。我們的研究發(fā)現(xiàn)新生動物早期血液中WBC計數(shù)較高,該發(fā)育階段的WBC能否通過發(fā)育尚不完全、具有高通透特性[15]的BBB進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)尚未明了。

    綜上所述,雖然經(jīng)心臟采血,需要開胸,帶來了胸內(nèi)負壓環(huán)境的改變,對新生鼠的生理功能確實存在一定的影響。然而本實驗在比較了新生鼠經(jīng)右心室采血和鼠尾采血的區(qū)別后發(fā)現(xiàn),經(jīng)右心室采血所得血常規(guī)數(shù)據(jù)中,RBC破壞程度小,PLT值穩(wěn)定,結(jié)果更可靠。因此,對新生鼠右心室血液的采集與檢驗,能夠建立正常新生鼠不同發(fā)育階段的血常規(guī)指標參考范圍。同時,該參考范圍的建立揭示了新生鼠出生后血液系統(tǒng)經(jīng)歷了逐漸發(fā)育成熟的過程:早期血液中RBC未完全成熟,易受外界因素影響而發(fā)生溶血,從而導(dǎo)致RBC計數(shù)減少,同時SI升高;WBC計數(shù)也經(jīng)歷了早期高,隨發(fā)育而逐漸降低的過程;PLT計數(shù)也由低逐漸升高,提示凝血系統(tǒng)逐漸走向成熟。這些與個體發(fā)育過程密切相關(guān)的改變,及其發(fā)育早期的特殊性,為我們進一步研究新生兒疾病的發(fā)生發(fā)展提供了基礎(chǔ)和新的思路。

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