MLST分型技術(shù)在鏈球菌屬中的相關(guān)參數(shù)

張 穎，王卓林，張志美，王艷萍，徐倩倩，郭時金，沈志強

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.山東綠都安特動物藥業(yè)有限公司，山東 濱州 256600；3.哈爾濱北方森林動物園，黑龍江 哈爾濱150322)

多位點序列分型(Multi-locus sequence typing, MLST)是在基因水平上通過測定多個管家基因的核苷酸序列來發(fā)現(xiàn)細菌變異的分型方法。多序列位點分型技術(shù)首先于1998年由Maiden等[1]應用于革蘭氏陰性病原菌的研究，后來逐漸在許多病源微生物、環(huán)境細菌和真核生物中得到應用。MLST技術(shù)是由多位點酶電泳(multilocus enzyme electro-phoresis, MLEE)技術(shù)發(fā)展而來，MLEE技術(shù)于1966年被首先應用，之后被廣泛用于病原微生物的流行病學研究中，但是由于MLEE方法是基于蛋白質(zhì)水平上的研究，無法檢測出某些核酸水平的變化。MLEE技術(shù)屬于表型分型技術(shù)，是通過生物個體間多位點酶的差異來反映其遺傳上的差異；而MLST技術(shù)不是分析基因的表達產(chǎn)物，而是分析基因的核苷酸序列。一個基因突變后形成不同的核苷酸序列，突變的核苷酸序列被定義為這個基因的等位基因[2]。此方法具有很多明顯的優(yōu)勢。首先，簡單方便，可重復性強，只需通過國際互聯(lián)網(wǎng)就能對某一具體致病菌株在全球范圍內(nèi)的傳播分布情況進行追蹤監(jiān)控；其次，由于細菌易出現(xiàn)自發(fā)性突變和與外源性基因的重組整合，克隆常呈現(xiàn)多樣性特征。因此，莢膜多糖分群的傳統(tǒng)血清學分型方法不能準確反映菌株的譜系關(guān)系，已無法滿足細菌的分子流行病學研究，只僅僅適用于細菌性疾病暴發(fā)時的鑒別診斷。MLST技術(shù)則可以分析菌株的譜系關(guān)系，發(fā)現(xiàn)那些用常規(guī)的表型方法不能分型的菌株以及新出現(xiàn)變異的菌株。

MLST技術(shù)對多個管家基因核苷酸序列進行直接測序，所選擇的位點序列通常位于管家基因內(nèi)部，從而能夠鑒定其位點上的遺傳變異情況。選擇的管家基因是那些通常肯定存在，并有足夠的變異度來適應在這些位點產(chǎn)生變異的等位基因[3]。管家基因幾乎都有保守性，但不同種屬或同一種不同的菌株之間又有差異即變異性。通過核酸序列的測序可直接反映出管家基因的變異情況。一般都選7個管家基因的DNA序列(450～500 bp)，選取分散于基因組內(nèi)部的多個位點會很大程度地提高區(qū)分能力，并且能夠建立起那些彼此相關(guān)的菌株之間的進化軌跡。MLST方法是針對管家基因內(nèi)部序列設計引物，然后進行PCR擴增反應和對PCR產(chǎn)物進行序列測定，每個位點的序列根據(jù)其發(fā)現(xiàn)的時間順序賦予一個等位基因編號，每一株菌的等位基因編號按照指定的順序排列就是它的等位基因譜，即這株菌的序列型 ST(sequence type)。這樣得到的每個ST均代表一組單獨的核酸序列信息，然后再進行等位基因圖譜(allelic profile)或序列類型(sequence types, STs)的鑒定，根據(jù)得到的等位基因圖譜使用配對差異矩陣(matrix pair-wise differences)等方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹圖進行聚類分析[4]。需要注意的是，一般7個管家基因的內(nèi)部序列才能夠得到一個菌株的等位基因圖譜，且序列一定要與定義的等位基因相一致。序列必須呈線性，而且必須準確，否則即使一個信息錯誤，都會使菌株從一個已知的突變?yōu)橐粋€未知的等位基因。

1 MLST技術(shù)在無乳鏈球菌中的相關(guān)參數(shù)

無乳鏈球菌(S.agalactiae)又叫B群鏈球菌，是一種人畜共患菌。無乳鏈球菌是一種常見病原菌，能引起動物和人感染，能夠引起羊和奶牛的急、慢性乳房炎，人類敗血癥、腦膜炎、肺炎、化膿性關(guān)節(jié)炎、子宮內(nèi)膜炎、泌尿道感染等，也是引起奶牛隱性乳房炎的重要致病菌之一。感染無乳鏈球菌的奶牛所產(chǎn)的乳汁中的乳糖及蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成份含量會下降，能直接影響乳品的質(zhì)量，降低奶牛的產(chǎn)奶量；患隱性乳房炎的奶牛乳汁中的無乳鏈球菌及其產(chǎn)生的毒素能直接影響乳品質(zhì)量，食用這樣的乳制品后可引起人嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、脫水等，嚴重危害食用者健康和公共衛(wèi)生安全。我國食品法明確規(guī)定，應用抗生素治療隱性乳房炎后的72～96 h之內(nèi)的乳品不能食用；如長期應用抗生素無乳鏈球菌會產(chǎn)生耐藥性，耐藥菌會隨著食物鏈進行傳播擴散，導致消費者產(chǎn)生對某種抗生素藥物的耐藥性，給人類的健康和生命安全造成嚴重的威脅[5]。

MLST技術(shù)在無乳鏈球菌中選用以下7個管家基因：(1)乙醛還原酶，(2)苯丙氨酰基tRNA合成酶，(3)谷氨酰胺運載蛋白，(4)谷氨酰胺合成酶，(5)絲氨酸脫水酶，(6)葡萄糖激酶，(7)酮糖移轉(zhuǎn)酶基因。所用的引物序列和擴增長度如表1所示。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，33個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

表1 無乳鏈球菌管家基因位點的相關(guān)試驗參數(shù)Table 1 The relevant experimental parameters of the housekeeping gene locus of S.agalactiae

2 MLST分型技術(shù)在停乳鏈球菌似馬亞種中的相關(guān)參數(shù)

停乳鏈球菌似馬亞種(Streptococcus dysgalactiae subspecies equisimilis, SDSE)是一種新出現(xiàn)的全球病菌，屬于C群鏈球菌，一般可感染獸類，致動物出現(xiàn)膿腫、心內(nèi)膜炎及乳腺炎，以前感染人的情況少見，最近幾年才出現(xiàn)感染人的病例報導[6]。此病曾在我國“非典”時期發(fā)生[7]。

MLST技術(shù)在停乳鏈球菌似馬亞種中選用以下7個管家基因，分別是葡萄糖激酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)運蛋白、谷氨酸消旋酶、DNA錯配修復蛋白、酮糖移轉(zhuǎn)酶、黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和乙酰乙酰輔酶A硫解酶。所用的引物序列和擴增長度如表2所示。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性 45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，34個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

3 MLST分型技術(shù)在肺炎鏈球菌中的相關(guān)參數(shù)

肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)為人獸共患菌，主要侵害剛斷奶仔豬，近年來曾多次發(fā)生，無季節(jié)性。發(fā)病率時高時低，與天氣變化有一定聯(lián)系；不及時治療一般會死亡，但肥育豬發(fā)病率和病死率都較低。用恩諾沙星等藥物治療有一定效果，用青霉素治療效果不好[8]。本菌為條件致病菌，約有20%～40%正常的人群和動物的上呼吸道中存在此菌，當機體抵抗力下降時可發(fā)生內(nèi)源性感染，同時也可發(fā)生外源性感染；可導致人的大葉性肺炎、化膿性胸膜炎、腦膜炎、敗血癥等，因此在本病防治工作中應注意人體保護[9]。

表2 停乳鏈球菌管家基因位點的相關(guān)試驗參數(shù)Table 2 The relevant experimental parameters of the housekeeping gene locus of SDSE

肺炎鏈球菌的MLST數(shù)據(jù)庫現(xiàn)在包含5000株左右的菌株，MLST技術(shù)在此病中有7個管家基因，分別為莽草素脫氫酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、葡萄糖激酶、酮糖移轉(zhuǎn)酶、信號肽酶、黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶及D-丙氨酸連接酶。所用的引物序列和擴增產(chǎn)物大小如表3所示。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

表3 肺炎鏈球菌管家基因位點的相關(guān)試驗參數(shù)Table 3 The relevant experimental parameters of the housekeeping gene locus of S. pneumoniae

4 MLST分型在化膿性鏈球菌中的相關(guān)參數(shù)

化膿性鏈球菌(也稱為A組鏈球菌屬，GAS)是鏈球菌屬中最重要的致病菌，是兒童和成人呼吸道感染的重要病原菌，是具有高度流行性的細菌性病原體，全世界都有分布，據(jù)目前所知，人類是其唯一的生物學宿主，多數(shù)時候，GAS易感染外表組織，包括上呼吸道的粘膜上皮組織或皮膚的表皮層，分別導致咽炎或膿皰病[10]。在臨床上常引起急性咽炎、丹毒、膿包病、猩紅熱、醫(yī)源性傷口感染和產(chǎn)后感染等，此外化膿性鏈球菌感染還可發(fā)生急、慢性風濕熱和急性腎小球腎炎等嚴重變態(tài)反應性并發(fā)癥[11]。

化膿性鏈球菌的MLST數(shù)據(jù)庫現(xiàn)在包含超過1000種菌株信息，MLST技術(shù)在化膿性鏈球菌中選用7個管家基因分別是乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖激酶、黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、酮糖移轉(zhuǎn)酶、谷氨酸消旋酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移白和DNA錯配修復蛋白。所用的引物序列和擴增長度如表4所示。PCR反應條件如下：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，32個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

表4 化膿鏈球菌管家基因位點的相關(guān)試驗參數(shù)Table 4 The relevant experimental parameters of the housekeeping gene locus of GAS

5 MLST分型技術(shù)在豬鏈球菌中的相關(guān)參數(shù)

豬鏈球菌(S.suis)是革蘭氏陽性菌，豬鏈球菌病是由致病性鏈球菌引起的一種人畜共患急性傳染病，屬國家規(guī)定的二類動物疫病。S.suis作為一個重要的人獸共患致病性病原菌感染宿主后，可導致宿主出現(xiàn)敗血癥、腦膜炎、肺炎、心內(nèi)膜炎和關(guān)節(jié)炎等。至今為止，根據(jù)莢膜多糖抗原的不同，S.suis有35個血清型。所有的血清型都能引起宿主感染，但豬鏈球菌血清2型(SS2)是引起宿主感染的最常見血清型[12]。自1968年丹麥[13]第一次報道有SS2感染人事件到2008年12月份為止，世界上共有400多例人感染病例被報道。1990年，在我國廣東省首次發(fā)現(xiàn)豬群中有類似SS2鏈球菌病的發(fā)生，但未見人與人之間的感染事件。1998～1999年，江蘇省[14]和浙江省的部分地區(qū)，在病豬中分離出豬鏈球菌菌株，經(jīng)鑒定為SS2鏈球菌。2005年6月下旬，四川省資陽、內(nèi)江等地有近80例患者急性發(fā)病，并有12例重癥患者死亡，經(jīng)鑒定后確診為為2型豬鏈球菌感染。2006年入夏以來，我國的浙江、江西、安徽、江蘇、湖南等省的部分地區(qū)出現(xiàn)了以高熱為主要特征的豬病疫情，并迅速蔓延[15]。經(jīng)分離鑒定，有2型豬鏈球菌感染。

MLST豬鏈球菌數(shù)據(jù)庫是由King等建立并發(fā)展充實的。意大利學者Princivalli等[16]對2003年至2007年間分離的菌株進行MLST研究時發(fā)現(xiàn)，ST1型菌株主導著這幾年的流行。與歐洲報道的相比，我國的分離株則以ST7型為主，其次是ST1型。葉長蕓等[17]對國內(nèi)兩次暴發(fā)(1998年江蘇、2005年四川)的豬鏈球菌菌株進行研究時，發(fā)現(xiàn)114株分離菌株中有106株分離菌株屬于ST7型。王洪敏等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在5株廣東省人源SS2中有3株屬于ST7型，有2株屬于ST1型。ST7型菌株能刺激機體T細胞大量增殖并能誘導致炎因子釋放，并且這個能力比ST1型菌株強[18]。

MLST技術(shù)在豬鏈球菌中選用的7個管家基因分別為5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶、葡萄糖激酶、60 KDa大小的分子伴侶、抗過氧化物、同源重組基因、天冬氨酸激酶及DNA錯配修復蛋白。所用的引物序列和擴增長度如表5所示。PCR反應條件如下：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

表5 豬鏈球菌管家基因位點的相關(guān)試驗參數(shù)Table 5 The relevant experimental parameters of the housekeeping gene locus of S. suis

6 展 望

這種基于核酸序列測定的方法可以準確地記錄細菌基因水平上的變異，并且核酸序列可以通過互聯(lián)網(wǎng)方便地傳遞，所以MLST被用于研究細菌的流行病學、群體生物學、致病性和進化關(guān)系。MLST作為一種直接在基因水平上對微生物進行分型的方法，既適用于分子流行病學研究，也適用于分子進化學研究。因此，MLST成為近年來發(fā)展迅速的微生物分型方法。

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