涼血化瘀方對(duì)急性肝損傷大鼠線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑的影響*

周 瓊 畢 蕾 顏曉靜 姜澤群 陳衛(wèi)平△

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

筆者前期的研究已初步探明了涼血化瘀方通過(guò)抗細(xì)胞凋亡保護(hù)肝細(xì)胞防治肝損傷［1］。本實(shí)驗(yàn)將在此基礎(chǔ)上用D-氨基半乳糖（D-GalN）聯(lián)合內(nèi)毒素脂多糖（LPS）以仿造人類肝炎法建立大鼠急性肝損傷模型，觀察涼血化瘀方對(duì)肝細(xì)胞凋亡和線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）途徑相關(guān)蛋白的影響，進(jìn)一步探討涼血化瘀方抗肝細(xì)胞凋亡的途徑和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SD健康雄性大鼠50只，體質(zhì)量200～250g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（滬）-2012-0002。

1.2 藥物 涼血化瘀方組成：赤芍、生地黃、制大黃。藥材購(gòu)于安徽省亳州市藥材公司，由南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定。稱取赤芍300 g，生地黃200 g，制大黃200 g置不銹鋼鍋中加水3000 mL浸潤(rùn)1 h，然后置電爐上加熱煎煮3次，煎煮時(shí)間分別為1h、40min、40 min，過(guò)濾合并濾液，濃縮成含生藥量1 g/mL，備用。使用時(shí)用0.9%氯化鈉注射液稀釋至所需濃度。按體表面積換算大鼠每日用量，等效量為 4506.5 mg/（kg·d），臨用前用蒸餾水配成所需濃度（低、中、高劑量分別為1/2、1、2 倍等效量）。

1.3 試劑及儀器 試劑D-GalN購(gòu)自南京美好生物工程研究所，批號(hào)：110225。內(nèi)毒素LPS購(gòu)自 Sigma公司，貨號(hào)為O127：B8。TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒（FITC標(biāo)記POD法，石蠟切片專用）購(gòu)自 Roche公司。兔抗大鼠 Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、Chop 多克隆抗體和相應(yīng)二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。β-actin購(gòu)自CST公司。ECL發(fā)光試劑購(gòu)自Pierce公司，其余試劑為分析純。儀器為OLYMPUS熒光多功能顯微鏡，日本OLYMPUS公司生產(chǎn)。JEM-1010透射電鏡為JEDL公司生產(chǎn)。臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)5810R型，Eppendorf公司。臺(tái)式低速離心機(jī)80-2型，上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司。電泳系統(tǒng)：Mini-Proten Tetra System，Bio-RAD公司。圖像分析儀：CMIAS98A，北航。凝膠成像儀：GelDoc 2000 System，Bio-RAD 公司。

1.4 分組與造模 SD健康雄性大鼠50只，動(dòng)物從1～50編號(hào)，采用SPSS12.0編程，隨機(jī)分成5組，正常對(duì)照組，模型組，涼血化瘀方高、中、低劑量組。末次給藥后1 h，除正常對(duì)照組外，其余4組按0.1 mL/10 g腹腔注射 GalN（50 mg/mL） +LPS（0.48 μg/mL），造成大鼠急性肝損傷模型。造模后6 h取肝組織檢測(cè)指標(biāo)（前期實(shí)驗(yàn)表明造模6 h細(xì)胞凋亡率達(dá)高峰，以下各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)將參考此時(shí)間點(diǎn)設(shè)計(jì)指標(biāo)檢測(cè)時(shí)間）。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) （1）肝組織病理檢測(cè)。大鼠肝臟離體后經(jīng)10%甲醛固定、取材、脫水、浸蠟、包埋，再切成4 μm厚切片，HE染色，光鏡觀察，同時(shí)對(duì)肝組織病變程度作半定量分析。（2）電鏡觀察肝細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)。取1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小肝組織置于戊二醛溶液（25 g／L）中固定，1%鋨酸后固定，超薄切片，電鏡下觀察肝細(xì)胞、細(xì)胞器的形態(tài)及結(jié)構(gòu)變化，并注意觀察有無(wú)凋亡的典型形態(tài)學(xué)變化。（3）TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)。①常規(guī)石蠟組織切片的預(yù)處理后，進(jìn)入標(biāo)記反應(yīng)。②陽(yáng)性對(duì)照樣本的準(zhǔn)備：組織樣本在蛋白酶K處理、PBS浸洗后，再加入100 μL DNaseⅠ反應(yīng)液室溫37℃處理10～30 min。③陰性對(duì)照樣本的準(zhǔn)備：在標(biāo)記反應(yīng)制備TdT酶反應(yīng)液時(shí)，不添加TdT酶，其余步驟均相同。④標(biāo)記和顯色反應(yīng)：預(yù)處理好的樣本PBS漂洗兩次，樣本周圍用吸水紙吸干，每個(gè)樣本滴加50 μL TdT酶反應(yīng)液，加蓋玻片37℃避光濕潤(rùn)反應(yīng)60 min（陰性對(duì)照片不加TdT酶），PBS漂洗3次，樣本周圍用吸水紙吸干，滴加50 μL Streptavidin-HRP工作液，加蓋玻片37℃濕潤(rùn)避光反應(yīng)30 min，PBS漂洗3次，滴加50～100 μL DAB工作液，室溫顯色反應(yīng)10 min，PBS漂洗3次，蘇木素常規(guī)染液復(fù)染。（4）Western blot檢測(cè)ERS 凋亡相關(guān)蛋白 Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、Chop。將少量組織塊置于勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎，加400 μL單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中進(jìn)行勻漿，用移液器將裂解液移至1.5 mL離心管中，4℃裂解30 min后12000 r/min離心10 min，取上清即為總蛋白。以BCA法測(cè)定蛋白濃度后，取10 μg蛋白加上樣緩沖液，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。電泳結(jié)束后濕法轉(zhuǎn)膜，然后用封閉液4℃封閉1 h，洗膜后加入適當(dāng)稀釋比例一抗抗體、孵育過(guò)夜，常規(guī)洗膜3次，繼而與二抗抗體室溫孵育2 h，常規(guī)洗膜，顯影，定影，讀取結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 肝組織病理學(xué)觀察 見(jiàn)表1。正常對(duì)照組肝臟由多邊行的肝小葉組成，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，中央靜脈無(wú)明顯充血，肝竇無(wú)擴(kuò)張、充血，枯否氏細(xì)胞無(wú)增生，肝細(xì)胞無(wú)變性或壞死，胞漿內(nèi)有糖原空泡，與處死前禁食不好有關(guān)，門管區(qū)小葉間動(dòng)脈、小葉間靜脈和小葉間膽管無(wú)異常，間質(zhì)無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)纖維組織增生。模型組與正常對(duì)照組相比，肝臟有點(diǎn)狀壞死，肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，系D-GalN+LPS造成肝臟損傷的典型表現(xiàn)。涼血化瘀方組變性壞死明顯減少，炎癥細(xì)胞數(shù)減少，肝組織的損傷修復(fù)程度較好，顯示了其對(duì)GalN+LPS所致大鼠急性肝損傷的抑制作用。

表1 各組病理半定量分析結(jié)果和凋亡細(xì)胞數(shù)比較（）

表1 各組病理半定量分析結(jié)果和凋亡細(xì)胞數(shù)比較（）

與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

2.2 電鏡觀察肝細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu) 電鏡觀察顯示，模型組肝細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核型態(tài)不規(guī)則，核膜皺縮，并可見(jiàn)部分肝細(xì)胞呈凋亡樣改變，細(xì)胞體積明顯縮小，染色質(zhì)凝聚，見(jiàn)圖1-1；胞質(zhì)內(nèi)線粒體明顯腫脹，線粒體嵴稀疏，排列紊亂，基質(zhì)空泡化，可見(jiàn)有絮狀電子致密物出現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)較多次級(jí)溶酶體，見(jiàn)圖1-2。治療組肝細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核呈圓形，線粒體無(wú)腫脹現(xiàn)象，但可見(jiàn)肝細(xì)胞內(nèi)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯增多，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂滴，見(jiàn)圖1-3、1-4。

2.3 TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè) 見(jiàn)表1。各組隨機(jī)挑選6個(gè)視野，CMIAS98A圖像處理系統(tǒng)體視學(xué)圖像分析凋亡細(xì)胞數(shù)密度，計(jì)算公式如下：凋亡細(xì)胞數(shù)密度=棕色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總面積×1000‰。各組凋亡細(xì)胞數(shù)密度分別為：模型組 6.23‰，正常對(duì)照組 1.45‰，涼血化瘀方高劑量組2.93‰，涼血化瘀方中劑量組2.62‰，涼血化瘀方低劑量組3.76‰。

圖1 各組肝細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)

2.4 Western blot檢測(cè)ERS凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、Chop 見(jiàn)圖2。涼血化瘀方各劑量組凋亡標(biāo)志蛋白 Caspase-9、Caspase-3、Chop的表達(dá)下調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)上調(diào)。

圖2 Western blot檢測(cè)ERS凋亡相關(guān)蛋白

3 討 論

內(nèi)毒素是觸發(fā)肝功能衰竭綜合癥的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［2］，可誘發(fā)肝細(xì)胞凋亡，繼而導(dǎo)致肝功能衰竭［3］。本實(shí)驗(yàn)顯示，涼血化瘀方有保護(hù)大鼠肝損傷和抗肝細(xì)胞凋亡作用。

肝細(xì)胞凋亡是造成肝損傷和肝臟疾病基本的中心環(huán)節(jié)［4-5］。細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制主要涉及死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡通路、以線粒體誘導(dǎo)的內(nèi)源性通路及近年研究發(fā)現(xiàn)ERS啟動(dòng)的凋亡途徑［6］。近期研究表明，ERS是線粒體應(yīng)激發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)［7］。筆者前期研究已顯示涼血化瘀方抗肝細(xì)胞凋亡作用，與死亡受體介導(dǎo)的凋亡相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)［8］，本實(shí)驗(yàn)則從線粒體和ERS途徑進(jìn)一步探討涼血化瘀方抗肝細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

線粒體在肝細(xì)胞凋亡機(jī)制中已成為重要的研究對(duì)象，肝細(xì)胞損傷后線粒體功能障礙，膜通透性改變，凋亡蛋白包括Cyt-c、Caspase蛋白酶等從線粒體到胞漿，隨之引起 Caspase“瀑布式”活化和細(xì)胞死亡［9］。而 Bcl-2屬抑制細(xì)胞凋亡的家族成員之一，其可以與Cyt-c直接結(jié)合抑制Cyt-c的釋放，還能與Caspase-9和A-paf-1結(jié)合并固定于線粒體上從而阻止caspase級(jí)聯(lián)激活。本實(shí)驗(yàn)研究顯示涼血化瘀方在下調(diào)Caspase-9、Caspase-3蛋白表達(dá)的同時(shí)，還能上調(diào)Bcl-2蛋白的上調(diào)，從而有效抑制肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生，保護(hù)肝細(xì)胞。

Chop基因的激活轉(zhuǎn)錄則是ERS誘導(dǎo)凋亡的途徑之一［10］，持續(xù)的 ERS 誘發(fā)轉(zhuǎn)錄活化因子 4（ATF4）的翻譯進(jìn)程，亦可引起Chop表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［11］。實(shí)驗(yàn)中涼血化瘀方治療組肝細(xì)胞中Chop表達(dá)得以下調(diào)，說(shuō)明其對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡通路也有一定的作用。

綜上所述，Caspase-9是線粒體途徑細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白之一，由Cyt-c激活，活化的Caspase-9再激活下游的效應(yīng)酶如Caspase-3等，進(jìn)而誘發(fā)凋亡反應(yīng)。Chop是ERS誘導(dǎo)凋亡的主要調(diào)節(jié)蛋白，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性細(xì)胞凋亡的發(fā)生具有特異相關(guān)性。Bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)蛋白，在線粒體和ERS途徑細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。本研究結(jié)果顯示涼血化瘀方對(duì)上述蛋白表達(dá)均有影響，提示其抗肝細(xì)胞凋亡作用與對(duì)線粒體和ERS途徑關(guān)鍵蛋白表達(dá)調(diào)控相關(guān)，而涼血化瘀方對(duì)ERS與線粒體途徑交互作用的調(diào)節(jié)機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

［1］畢蕾，陳衛(wèi)平，李衛(wèi)娜，等.涼血化瘀方對(duì)肝衰竭大鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009，15（3）：32-34.

［2］于海波，宋為蕓，王東林，等.慢性重型肝炎患者內(nèi)毒素檢測(cè)及臨床意義［J］.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，1998，8（4）：232.

［3］王宇明，陳耀凱，顧長(zhǎng)海，等.重型肝炎命名和診斷分型的再認(rèn)識(shí)—附477例臨床分析［J］.中華肝臟病雜志，2000，8（5）：261-263.

［4］Jaeschke H，Gujral JS，Bajt ML.Apop tosis and necrosis in liver disease［J］.Liver Int，2004，24（2）：85-89.

［5］吳濤，季光，鄭培永，等.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝細(xì)胞凋亡［J］.世界華人消化雜志，2007，15（23）：2507-2515.

［6］關(guān)麗英，許彩民，潘華珍.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2007，34（11）：1136-1141.

［7］李載權(quán)，周愛(ài)儒，唐朝樞.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)分子機(jī)理研究進(jìn)展［J］.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2004，20（3）：283-288.

［8］陳衛(wèi)平，曾莉，丁斐，等.內(nèi)毒素肝損傷中FADDmRNA表達(dá)及涼血化瘀方的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)急癥雜志，2004，13（1）：39-40.

［9］趙小祺，王小榮，張靜.線粒體相關(guān)物質(zhì)與細(xì)胞凋亡［J］.河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2009，26（6）：80-82.

［10］吳濤，季光，鄭培，等.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝細(xì)胞凋亡［J］.世界華人消化雜志，2007，15（23）：2507-2515.

［11］Szegezdi E，Logue SE，Gorman AM，et al.Mediators of endoplasmicreticulumstress-inducedapoptosis［J］.EMBOreports，2006，7（9）：880-885.