蛋白質(zhì)α-N-末端乙?；揎椦芯窟M(jìn)展

黃忱，陳建華

α-N-末端乙?；揎棧é?N-terminal acetylation）是一種蛋白質(zhì) N-末端的修飾形式，是真核生物中最為普遍的蛋白質(zhì)修飾方式之一。雖然 α-N-末端乙酰化修飾早在 20 世紀(jì)70年代就被科學(xué)家所發(fā)現(xiàn)，但是到目前為止，其廣泛存在的意義仍未有定論。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)了 α-N-末端乙?；揎棸l(fā)生的規(guī)律，總結(jié)出了（X）PX 法則，探明了 α-N-末端乙酰化修飾對(duì)多種蛋白質(zhì)起著特異性的重要作用，使得人們更加清楚地了解細(xì)胞內(nèi)一些生化反應(yīng)發(fā)生的原理以及不同細(xì)胞通路的調(diào)節(jié)方式。此外，α-N-末端乙酰化蛋白質(zhì)的序列檢測(cè)方法也是近年來研究的熱點(diǎn)之一。本文簡(jiǎn)要綜述α-N-末端乙?；揎椀难芯窟M(jìn)展。

1 α-N-末端乙?；揎?/h2>

α-N-末端乙酰化修飾是一種十分普遍的蛋白質(zhì) N-末端修飾形式，由乙酰轉(zhuǎn)移酶（N-terminal acetyltransferase，NAT）催化，將乙酰輔酶 A（acetyl-CoA，AcCoA）的乙?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì) N-末端的 α-氨基上[1]，其結(jié)果是蛋白質(zhì)的總質(zhì)量增加 42 D。

新生肽鏈的第一個(gè)氨基酸通常是甲硫氨酸，大多數(shù)的新生肽鏈都必須經(jīng)過甲硫氨酸切除作用，即在甲硫氨酸胺肽酶的作用下，甲硫氨酸被切除，這一修飾發(fā)生在 α-N-末端乙?；揎椫啊．?dāng)新生肽鏈暴露出的第二位氨基酸符合一定條件時(shí)，即發(fā)生 α-N-末端乙酰化修飾反應(yīng)。

α-N-末端乙酰化修飾是一種蛋白質(zhì)的共翻譯修飾，當(dāng)新生肽鏈從核糖體中露出 25～50 個(gè)氨基酸殘基序列，即肽鏈仍與核糖體結(jié)合的時(shí)候就發(fā)生修飾，而作為翻譯后修飾的情況并不多見，這表明 N 末端修飾的方式從根本上取決于蛋白質(zhì) N 末端區(qū)域。

α-N末端乙?；揎検钦婧松镏凶顬槠毡榈牡鞍踪|(zhì)修飾方式之一，真核生物胞質(zhì)蛋白進(jìn)行 α-N-末端乙?；揎椀谋壤秊?80%～90%，但是原核生物和古細(xì)菌蛋白鮮少被乙?；Ｖ参镏斜灰阴；牡鞍踪|(zhì)比例未知，但是SWISS-PROT 中已知 N 末端序列的成熟蛋白數(shù)量很少，僅包括細(xì)胞色素 C、組蛋白和一些代謝酶。無脊椎動(dòng)物中N 末端乙?；牡鞍踪|(zhì)數(shù)量也很少。

2 α-N-末端乙酰轉(zhuǎn)移酶及分類

α-N-末端乙?；揎椨?α-N-末端乙酰轉(zhuǎn)移酶（NAT）催化，目前已發(fā)現(xiàn)了 6 種真核 NAT，幾乎全部或部分與核糖體相關(guān)，分別為 NatA～NatF。前 5 種（NatA～NatE）在人和酵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并且較為保守，NatF 僅在高等真核生物中發(fā)現(xiàn)。每一種 NAT 都由一個(gè)以上的亞基組成并有著不同的 N-末端底物序列。最早被發(fā)現(xiàn)的 NatA 由催化亞基Ard1（Naa10p）、輔助亞基 Nat1（Naa15p）和 Nat5 組成，在肽鏈完成甲硫氨酸的切除作用后催化由 Ser-、Ala-、Thr-、Val-、Gly-、Cys- 為 N-末端的乙?；揎?。酸性氨基酸殘基 Asp-、Glu- 為 N-末端的肽鏈可能進(jìn)行由 NatA 或 Ard1單亞基催化的翻譯后乙?；揎梉2]。最近又有研究指出，NatA 中可能含有一種新的功能組分——分子伴侶樣蛋白HYPK[3]。NatB 由催化亞基 Nat3（Naa20p）和輔助亞基Mdm20（Naa25p）組成，能夠?qū)σ?Met-Asp-、Met-Glu-、Met-Asn- 為 N-末端的底物肽鏈進(jìn)行乙?；揎梉4]。NatC由催化亞基 Mak3（Naa30p）和輔助亞基 Mak10（Naa35p）、Mak31（Naa38p）組成，受其催化的底物肽鏈的 N-末端有著 Met-Leu-、Met-Ile-、Met-Tyr-、Met-Phe- 等序列[5]。NatD含有催化亞基 Nat4（Naa40p）能夠催化 N-末端為 Ser- 的酵母組蛋白 H2A 和 H4 進(jìn)行 N-末端乙?；揎梉6]。NatE含有催化亞基 Nat5（Naa50p），與 NatA 的亞基 Ard1 及Nat1 相關(guān)[7]。Nat5 的體外實(shí)驗(yàn)指出其能夠使 Met-Leu- 及相似序列乙?；?，然而其體內(nèi)活性及是否依賴 Ard1 和Nat1 而起作用尚不明確。NatF 作為最新發(fā)現(xiàn)的一種 NAT，只存在于高等真核生物細(xì)胞中，含有催化亞基 Naa60p，底物 N-末端序列為 Met-Lys-，Met-Ala-，Met-Leu- 等[8]。

雖然在原核生物中，蛋白質(zhì)的 α-N-末端乙酰化修飾并不普遍，但是在大腸桿菌中已發(fā)現(xiàn) Rim I、Rim J[9]和 Rim L[10]三種 NAT，分別催化乙酰化核糖體蛋白 S18、S5 和L7/L12。

3 α-N-末端乙?；揎椀?X)PX 法則與分子機(jī)制

對(duì)于 α-N-末端乙?；揎椃磻?yīng)來說，新生肽鏈、乙酰轉(zhuǎn)移酶、AcCoA 等都是必要條件。可是研究人員發(fā)現(xiàn)，并不是所有的新生肽鏈在乙酰轉(zhuǎn)移酶和 AcCoA 的存在下就能夠發(fā)生 α-N-末端乙?；揎?。在對(duì) α-N-末端乙?；揎椓说牡鞍踪|(zhì)序列進(jìn)行總結(jié)后，研究人員提出了（X）PX 法則[11]。該法則認(rèn)為，當(dāng)脯氨酸存在于肽鏈的第二位，第一位存在起始甲硫氨酸或者在第三位存在一個(gè)有著回轉(zhuǎn)半徑較小的氨基酸時(shí)，肽鏈的 α-N-末端乙?；揎椬饔镁筒荒馨l(fā)生。這一法則為研究人員研究去除末端乙?；鶊F(tuán)后蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、功能、位置等問題提供了可能。但也有特例，SP-starting Ymr090w 蛋白的新生肽鏈雖然符合（X）PX 規(guī)則但仍被 NatA 進(jìn)行了 α-N-末端乙?；揎?，并且連接上了 NatA 依賴型AcN-降解決定子。這說明（X）PX 法則仍有待完善。

α-N-末端乙?；揎椷^程中 NAT 的多種亞基之間如何相互作用尚無定論。到目前為止，研究人員僅對(duì)釀酒酵母的 NatA 催化 α-N-末端乙?；揎棔r(shí)三種亞基與核糖體作用的分子機(jī)制提出了一種假設(shè)。

釀酒酵母的 NatA 是迄今研究最為透徹的 α-N-末端乙酰化酶。如前所述，NatA 主要由催化亞基 Ard1 和輔助亞基 Nat1 兩個(gè)亞基組成。只有當(dāng) Ard1 和 Nat1 同時(shí)過表達(dá)時(shí)乙?；D(zhuǎn)移酶活性才能提高。Nat1 或 Ard1 發(fā)生異常都會(huì)使 NatA 功能喪失，導(dǎo)致酵母表現(xiàn)出多重表型異常，包括慢生長(zhǎng)、不能進(jìn)入 G0期和形成孢子以及對(duì)沉默接合型位點(diǎn)失去抑制、導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定[12]等。

Gautschi 等[13]通過研究發(fā)現(xiàn)了 NatA 的第三種亞基Nat5。同時(shí)提出了 NatA 的三種亞基與核糖體相互作用的機(jī)制：Nat1 介導(dǎo)催化底物和核糖體大亞基之間穩(wěn)定的相互作用，同時(shí)，Nat1 與剛從核糖體管狀出口露出約 40 個(gè)氨基酸殘基的新生肽鏈相結(jié)合。Nat1 將正在延伸的肽鏈引導(dǎo)到催化亞基 Ard1 和可能的催化亞基 Nat5，兩個(gè)催化亞基將AcCoA 上的乙?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移到肽鏈的 α-N-末端。當(dāng) Nat1 與核糖體亞基緊密結(jié)合時(shí) Ard1 才能發(fā)揮催化作用，但是，Nat5 是否通過 Nat1 或（和）Ard1 與核糖體亞基相互作用尚不明確。如果沒有 Nat1 的存在，催化亞基可能對(duì)新生肽鏈沒有或者僅有很小的親和力。因此，含有 Nat1 的穩(wěn)定的反應(yīng)復(fù)合物對(duì)于 N-α-乙?；饔脕碚f是十分重要的。Nat1和 Ard1 之間反應(yīng)復(fù)合物的形成可能通過 C-末端的卷曲螺旋區(qū)域。

4 α-N-末端乙?；揎椀淖饔?/h2>

α-N-末端乙?；揎楇m然普遍存在，但是對(duì)其作用人們還知之甚少，僅籠統(tǒng)地認(rèn)為 α-N-末端乙?；揎椩诿富钚?、穩(wěn)定性、DNA 結(jié)合、蛋白質(zhì)相互作用及受體識(shí)別中起作用。

早前有研究者認(rèn)為由于蛋白質(zhì)翻折需要泛素化依賴的降解系統(tǒng)，而這個(gè)系統(tǒng)又依賴 N 端游離的 α-NH2基團(tuán)[14]，所以有理由相信 α-N-末端乙?；诜乐沟鞍踪|(zhì)水解中起到重要作用。但是最近有研究指出，α-N-末端乙?；軌虍a(chǎn)生特異性降解信號(hào)[15]。研究者發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母中 N-末端乙?；说募琢虬彼釟埢軌蜃鳛榻到庑盘?hào)（AcN-降解決定子），被泛素連接酶 Doa10 識(shí)別，從而導(dǎo)致被標(biāo)記蛋白質(zhì)的降解。另外，N-末端為乙?；说?Ala-、Val-、Ser-、Thr-、Cys- 殘基的蛋白質(zhì)同樣能被 Doa10 識(shí)別。

α-N-末端乙?；揎椀纳飳W(xué)意義僅具體到數(shù)量有限的蛋白質(zhì)上，如蛋白質(zhì)位置的移動(dòng)，蛋白質(zhì)復(fù)合物的合成和酶動(dòng)力學(xué)等。例如，Arl 蛋白[16]是一種 GTP 酶，在亞細(xì)胞細(xì)胞器的定位上起著決定性的作用。當(dāng)處于 GTP 結(jié)合狀態(tài)時(shí)，Arl 蛋白的 N 末端疏水螺旋暴露出來，使其能與磷脂雙分子層相互作用。GTP 水解后，變?yōu)?GDP 結(jié)合狀態(tài)的Arl 蛋白的 N 末端疏水螺旋埋入內(nèi)部，因而蛋白從磷脂膜離開。α-N-末端乙?；揎検墙湍竷捎H性螺旋 Arl3p 結(jié)合到高爾基體上以及 hArl8b 結(jié)合到溶酶體上的先決條件。在這些情況下，α-N-末端乙?；揎椝坪跄軌蛉〈?N-豆蔻酰化、N-棕櫚?；刃?GTP 酶定位到膜上所需的脂肪酸修飾的替代反應(yīng)。

Ashiuchi 等[17]研究指出，α-N-末端乙酰化修飾與血紅蛋白亞基的質(zhì)子化作用有關(guān)，能夠影響血紅蛋白的四聚體聚合強(qiáng)度和協(xié)調(diào)性。引起地中海貧血的原因是血紅蛋白基因發(fā)生突變，第 2 位的纈氨酸突變?yōu)楸彼幔沟玫鞍踪|(zhì)進(jìn)行了 α-N-末端乙?；?，從而導(dǎo)致了血紅蛋白氧親和力的下降。

Murthi 和 Hopper[18]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)去除編碼 N-末端乙酰轉(zhuǎn)移酶 NatC 亞基的基因時(shí)，報(bào)告蛋白 Trm 1-II-GFP 不能夠正確定位到內(nèi)層核膜上，而是定位到了核漿中。MS 檢測(cè)指出 Trm 1-II-GFP 蛋白是 N-末端乙?；模琋-末端去乙?；?Trm 1-II-GFP 不能夠進(jìn)行正確的定位，說明了 N-末端乙?；饔脤?duì)于 Trm 1-II-GFP 內(nèi)層核膜正確定位的重要性。但是 N-末端乙酰化并不是蛋白質(zhì)定位到內(nèi)層核膜的充分條件，可能 N-末端乙?；谟绊?Trm 1-II-GFP 結(jié)構(gòu)及順式-作用內(nèi)層核膜定位模體暴露過程中起到作用。表 1 總結(jié)了部分已知的 α-N-末端乙?；揎棇?duì)于特定蛋白質(zhì)的作用。

由表 1 可見，α-N-末端乙酰化修飾對(duì)于特定蛋白質(zhì)起著重要的作用，這使得人們能夠更好地理解細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)以及細(xì)胞通路調(diào)節(jié)細(xì)胞生理的機(jī)制。

5 α-N-末端乙酰化蛋白質(zhì)的序列測(cè)定方法

為了研究 α-N-末端乙?；揎椘毡榇嬖诘囊饬x，大規(guī)模測(cè)定蛋白質(zhì) N-末端序列并總結(jié)序列規(guī)律是十分必要的。然而，α-N-末端乙?；牡鞍踪|(zhì) N 末端被乙?；忾]，無法通過直接的 Edam 降解繼而使用間接肽序列測(cè)定技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)序列，也無法結(jié)合化學(xué)修飾進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

近年來對(duì)角線色譜法（combined fractional diagonal chromatography，COFRADIC）與強(qiáng)陽離子交換色譜法（strong cation exchange chromatography，SCX）的結(jié)合使用已逐漸成為蛋白質(zhì) N 末端序列測(cè)定的普遍使用方法[19]。將α-N-末端乙?；鞍踪|(zhì)用胰蛋白酶消化成多肽，經(jīng)過谷氨酸循環(huán)轉(zhuǎn)移酶和焦谷氨酸氨基肽酶的處理，在低 pH 條件下進(jìn)行強(qiáng)陽離子交換色譜分析。首輪對(duì)角線色譜過后，用三硝基苯磺酸對(duì)多肽進(jìn)行修飾，氧化甲硫氨酸，再進(jìn)行第二輪對(duì)角線色譜，最后通過 LC-MS/MS 檢測(cè)，就能對(duì)多肽進(jìn)行識(shí)別與定量分析。再對(duì)多肽片段進(jìn)行拼接，從而還原所測(cè)蛋白質(zhì)的 N 末端序列。Aivaliotis 等[20]在對(duì)兩種嗜鹽古生菌Halobacterium salinarum 的 606 種蛋白質(zhì)和 Natronomona pharaoniss 的 328 種蛋白質(zhì) N 末端序列進(jìn)行測(cè)序的過程中就采用了對(duì)角線色譜法和強(qiáng)陽離子交換色譜。這兩種蛋白質(zhì) N 末端序列鑒定方法的組合使用減少了原有蛋白質(zhì) N末端序列測(cè)定的步驟，更提高了序列測(cè)定的準(zhǔn)確性。

表1 α-N-末端乙?；揎棇?duì)于特定蛋白質(zhì)的作用

6 小結(jié)

α-N-末端乙?；揎検且环N廣泛存在的蛋白質(zhì)共翻譯修飾形式，但并未被完全認(rèn)知。研究人員已發(fā)現(xiàn) 6 種真核NAT，NAT 家族是否還有其他成員尚未可知。不遠(yuǎn)的將來，NAT 可能在生物催化乙?；鞍踪|(zhì)方面發(fā)揮重要作用。（X）PX 法雖然可以預(yù)測(cè)可能進(jìn)行 α-N-末端乙?；揎椀牡鞍踪|(zhì)，但仍有特例，這說明（X）PX 法則仍需完善；而將（X）PX 法則反其道而行之，若使蛋白質(zhì)的 N-末端序列符合（X）PX 法則就能保證該蛋白質(zhì)不會(huì)進(jìn)行 α-N-末端乙?；揎?。α-N-末端乙?；揎棇?duì)于特定蛋白質(zhì)具有防止降解或準(zhǔn)確定位的作用，這可能有希望應(yīng)用到藥物蛋白質(zhì)領(lǐng)域，在對(duì)藥物蛋白質(zhì)進(jìn)行 α-N-末端乙酰化修飾后使之延長(zhǎng)半衰期或增強(qiáng)藥物靶向治療效果。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，相信 α-N-末端乙?；揎椖軌蚋玫乇蝗藗兯J(rèn)識(shí)，并且應(yīng)用到生產(chǎn)生活中來。

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