缺血性腦血管病患者血漿甘露糖結(jié)合凝集素檢測及其啟動子區(qū)多態(tài)性分析

楊新玲，康少平，程健君，輦曉峰，劉雪晴，賈天軍（河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河北 張家口 075000）

以動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）為主要病理改變的缺血性腦血管?。╥schemic cerebrovascular disease，ICVD）是常見病、多發(fā)病，其病因和發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，近年來感染因素、炎性反應(yīng)在ICVD中作用得到高度關(guān)注［1］。病原體識別分子模式（pathogen recognition molecules pattern，PAMP）與相關(guān)模式識別受體（pattern recognition receptors，PRR）是研究的熱點(diǎn)，而甘露糖結(jié)合凝集素（mannose binding lectin，MBL）是較重要的PRR［2］，且與多種疾病的發(fā)病有關(guān)。國外研究［3－4］報(bào)道：MBL基因突變與心肌梗塞及2型糖尿病患者心血管疾病發(fā)病率增加有關(guān)。MBL基因多態(tài)性與人循環(huán)系統(tǒng)中MBL寡聚體含量和功能活性相關(guān)，已發(fā)現(xiàn)6個(gè)對血清MBL水平影響最大的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）位點(diǎn)。由于MBL啟動子區(qū)和結(jié)構(gòu)基因多態(tài)性，血漿中MBL含量變動很大，電子顯微鏡觀察到MBL二聚體到六聚體等不同的結(jié)構(gòu)聚體形式，人血漿MBL主要以六聚體為主［5］，但在疾病中的研究較少。因此，本研究采用ELISA法和Western blotting法檢測我國北方ICVD患者血漿MBL含量及存在形式，同時(shí)采用序列特異性引物－多聚酶鏈反應(yīng)（SSP－PCR）技術(shù)分析MBL基因啟動子區(qū)多態(tài)性，為ICVD的輔助診斷和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker（大連寶生物公司）；瓊脂糖、鹽酸胍（Sigma公司，美國）；MBL ELISA試劑盒（北京現(xiàn)代高達(dá)生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；鼠抗人的第一抗體（自制單抗）；HRP標(biāo)記的羊抗鼠第二抗體（南京金思特公司）；預(yù)染蛋白 Marker（凱基），DAB顯色液（哈爾濱?；锟萍加邢薰荆┑??；驍U(kuò)增梯度PCR儀、酶標(biāo)儀（Thermo公司，日本）；凝膠圖像分析系統(tǒng)（WD－9403F，北京）；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（DYY－7C型，北京）；電轉(zhuǎn)膜儀（北京六一儀器廠）等。

1.2 研究對象 選取2006年2月—2007年5月于河北北方學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的81例ICVD患者作為ICVD組，其中男性52例，女性29例，年齡53～73歲，平均（65±12）歲，入選患者均符合全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會議修訂的各類腦血管病診斷要點(diǎn)?；颊呷朐汉蟠稳涨宄?，用2mL EDTA－K2抗凝管收集空腹靜脈血標(biāo)本。選取同期于河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院保健科門診進(jìn)行健康體檢者（顱腦CT或MRI均無異常表現(xiàn)）60例作為對照組，其中男性40例，女性20例，年齡50～70歲，平均（60±10）歲。2組研究對象性別、年齡間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.09，P＝0.761；t＝1.05，P＝0.32），具有可比性。

1.3 標(biāo)本的處理 2h內(nèi)取1.2mL抗凝全血放入1.5mL離心管中，5000r·min－1離心5min，分離血漿，－80℃保存，供測定血漿MBL含量及寡聚體；有形細(xì)胞成分用于提取DNA，供MBL啟動子多態(tài)性檢測。

1.4 ELISA法檢測血漿 MBL含量 用 MBL ELISA試劑盒測定，嚴(yán)格按說明書操作，用酶標(biāo)儀比色，波長為450nm。每批標(biāo)本帶有標(biāo)準(zhǔn)液，濃度分別為 0、1、2、5、10、25、50和100μg·L－1，以標(biāo)準(zhǔn)參考品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血漿樣本中的MBL含量。

1.5 非還原SDS－PAGE和Western blotting法檢測血漿MBL寡聚體 根據(jù)ELISA結(jié)果將血漿蛋白樣品進(jìn)行標(biāo)化，與2×上樣緩沖液［0.125mol·L－1Tris－Cl，4%SDS，20%（V／V）Glyceral，0.02%溴酚藍(lán)］混勻，沸水浴5min，以使蛋白充分變性。Western blotting法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行：按SDS－PAGE常規(guī)電泳方法，分別采用濃度為15.0%和7.5% 的分離膠。PVDF膜提前用甲醇浸泡10min，90V恒壓冰浴轉(zhuǎn)膜3h。5%脫脂奶粉室溫封閉1h。0.1%PBST漂洗后，一抗（1∶500）4℃搖動孵育過夜，二抗（1∶2000）室溫孵育1h。PBST漂洗后，按照DAB顯色液操作說明顯色MBL特異條帶：將轉(zhuǎn)印后的膜放于干凈平皿中，加入現(xiàn)配的DAB顯色液，室溫放置5min，流水漂洗終止顯色反應(yīng)后拍照。樣品的Western blotting檢測均使用同一批試劑。

1.6 MBL啟動子多態(tài)性分析 ICVD患者與健康人標(biāo)本MBL基因啟動子多態(tài)性的檢測參照文獻(xiàn)［6］。用含0.5mg·L－1溴化乙錠1%的瓊脂糖凝膠電泳，DL 2000DNA Marker作為參照，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，組間各單倍型和基因型分布差異比較、組間性別均衡性檢驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn)；血漿MBL含量比較、組間年齡均衡性檢驗(yàn)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 血漿MBL含量 ICVD組和對照組受檢者血漿MBL含量分別為（3372.18±660.90）和（2065.29±195.67）μg·L－1，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝14.83，P＜0.01）。

2.2 血漿MBL存在形式 由于MBL以不同相對分子質(zhì)量的寡聚體存在，應(yīng)用2種不同濃度的SDS－PAGE凝膠（15.0%和7.5%）對血漿中 MBL蛋白分子進(jìn)行分離。15.0%分離膠 Western blotting結(jié)果顯示：ICVD組患者 MBL單體（約36000）表達(dá)高于對照組。見圖1。7.5%分離膠Western blotting結(jié)果顯示：ICVD組患者M(jìn)BL約250000寡聚體表達(dá)高于對照組；最為顯著的是MBL約130000寡聚體的表達(dá)，在ICVD組能夠清晰檢測到表達(dá)條帶，而在對照組幾乎檢測不到。見圖2。

圖1 血漿MBL 15.0%分離膠Western blotting檢測結(jié)果Fig.1 Western blotting detection results of plasma MBL with 15.0%separating gel

圖2 血漿MBL 7.5%分離膠Western blotting檢測結(jié)果Fig.2 Western blotting detection results of plasma MBL with 7.5%separating gel

2.3 MBL啟動子多態(tài)性在對照組和ICVD組中的分布 綜合分析SSP－PCR的結(jié)果可確定MBL啟動子單倍型與基因型在各組中的頻數(shù)（表1和2）。檢出6種單倍型：HXP、HYP、HYQ、LXP、LYP和LYQ。不同的單倍型中，HYP型人數(shù)最多，2組此型的構(gòu)成比比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝7.59，P＜0.05）；LXP單倍型頻數(shù)ICVD組明顯低于對照組（P＜0.05）。檢出15種基因型，其中HXP／HYP和HXP／LYQ僅見于ICVD組，HXP／LXP和HYP／LXP則僅見于健康對照組。不同的基因型中，HYP／HYP型人數(shù)最多，2組此型的構(gòu)成比比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝3.53，P＞0.05）；ICVD組LYQ／LYQ 基因型頻數(shù)明顯低于對照組（P＜0.05）。

3 討 論

目前懷疑肺炎衣原體是引發(fā)AS的重要病原。研究者［7］在對挪威患者的研究中得出MBL等位基因突變和嚴(yán)重的AS之間存在中等程度的相關(guān)性。加拿大患者突變的MBL等位基因與頸動脈斑塊增加具有顯著相關(guān)性［8］。這2個(gè)相對獨(dú)立的研究結(jié)果均提示感染因子在AS中的作用。而MBL似乎可以調(diào)節(jié)肺炎衣原體感染的嚴(yán)重程度，這可能解釋MBL基因突變與嚴(yán)重AS之間的關(guān)系。MBL蛋白基本結(jié)構(gòu)是由3條相同約32000的多肽鏈構(gòu)成的亞單位組成2～6個(gè)不等的寡聚體，電鏡下觀察呈“花束”樣結(jié)構(gòu)，與C1q分子類似。MBL的功能依賴于蛋白質(zhì)的多聚化程度和血漿水平，結(jié)構(gòu)基因變異可能會產(chǎn)生不同多聚化的產(chǎn)物，從而影響補(bǔ)體的激活，編碼區(qū)上游的變異會影響MBL血清濃度。已發(fā)現(xiàn)與MBL相關(guān)的基因突變位點(diǎn)外顯子Ⅰ的52位、54位和57位，以及啟動區(qū)域和非編碼區(qū)域的－550位、－221位和＋4位，所有這些突變位點(diǎn)可以發(fā)生在順式結(jié)構(gòu)或反式結(jié)構(gòu)中，由此產(chǎn)生不同單倍型。單倍型可以定義不同的等位基因，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)和不同量的多肽［9］。

表2 2組人群MBL啟動子各基因型的頻數(shù)Tab.2 The genotype frequencies of MBL promoter region of people in two groups ［n（η／%）］

MBL以多聚體形式存在于不同種族野生基因型的人群中。Dean等［10］用免疫印跡實(shí)驗(yàn)證明：LX啟動子單倍型對野生基因型和A／D基因型的人群MBL功能性寡聚體影響最大，能夠降低高相對分子質(zhì)量的寡聚體。蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，本研究采用ELISA和Western blotting方法分析血漿MBL蛋白含量及存在形式，發(fā)現(xiàn)ICVD組血漿MBL含量明顯高于對照組。ICVD組MBL單體含量較健康志愿者高，血漿中大量單體MBL蛋白分子存在，使MBL失去了各種保護(hù)功能，進(jìn)一步揭示了MBL結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。此外，ICVD組MBL在相對分子質(zhì)量為250000和130000左右的寡聚體表達(dá)高于對照組，推斷ICVD患者M(jìn)BL多聚體總的含量較健康對照組高。MBL作為急性期反應(yīng)蛋白，機(jī)體不同的生理及病理狀態(tài)均對MBL的表達(dá)產(chǎn)生影響，提示MBL在ICVD診斷和發(fā)生機(jī)制中起著重要的作用。本研究應(yīng)用SSP－PCR方法對MBL啟動子多態(tài)性進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ICVD患者HYP、LXP單倍型與健康對照組HYP、LXP比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他4種單倍型HXP、HYQ、LYP和LYQ在2組標(biāo)本中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。檢出15種基因型，其中HXP／HYP和HXP／LYQ僅見于ICVD患者，HXP／LXP和HYP／LXP則僅見于健康對照組；不同的基因型中，HYP／HYP型人數(shù)最多，2組此型的構(gòu)成比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ICVD組LYQ／LYQ基因型頻數(shù)明顯低于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示MBL啟動子單倍型和基因型頻數(shù)在ICVD發(fā)生中起到一定的作用。

綜上所述，ICVD與MBL啟動子多態(tài)性及其血漿含量、蛋白存在形式有關(guān)，這在冠心病和AS的機(jī)制探討及臨床診斷中具有重要的意義，但其確切作用機(jī)制尚未完全闡明。由于血漿MBL受多個(gè)SNP位點(diǎn)影響，同時(shí)研究樣本受地域和數(shù)量限制，MBL參與ICVD的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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