超高壓液相色譜熒光檢測(cè)法快速測(cè)定水中痕量苯胺與聯(lián)苯胺

王 超，呂怡兵，滕恩江，加那爾別克·西里甫汗，許人驥

(1.中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站，北京 100012;2.新疆環(huán)境監(jiān)測(cè)總站，新疆自治區(qū) 烏魯木齊 830011)

苯胺和聯(lián)苯胺是化工、印染和制藥等工業(yè)生產(chǎn)的重要原料，釋放到環(huán)境中會(huì)通過(guò)皮膚、呼吸道和消化道進(jìn)入人體，嚴(yán)重威脅人類健康。苯胺可造成急/慢性中毒，引起高鐵血紅蛋白癥、神經(jīng)衰弱、輕度貧血等;聯(lián)苯胺可引起接觸性皮炎、出血性膀胱炎和膀胱癌，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)認(rèn)定為1類致癌物質(zhì)(對(duì)人類致癌性證據(jù)充分)［1－2］。因此，美國(guó)、日本等國(guó)將其列入主要監(jiān)測(cè)項(xiàng)目或優(yōu)先監(jiān)測(cè)的污染物黑名單［3］。我國(guó)將苯胺和聯(lián)苯胺列為環(huán)境重點(diǎn)污染物，并在《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3838－2002)中規(guī)定苯胺和聯(lián)苯胺的標(biāo)準(zhǔn)限值分別為100 μg/L和0.2 μg/L。因此開(kāi)發(fā)一種高靈敏并且簡(jiǎn)單實(shí)用的方法，對(duì)于控制水體中苯胺和聯(lián)苯胺的污染，保證人類用水安全，具有重要意義。

目前已開(kāi)發(fā)基于不同檢測(cè)原理的方法主要有萘乙二胺偶氮光度法(NEAP)［4］、液相色譜紫外吸收法(HPLC/UV)［5－6］、液相色譜電化學(xué)檢測(cè)法(HPLC － EC)［7］、氣相色譜質(zhì)譜法(GC － MS)［8］、超臨界流體色譜法［9］、電極法［10］、電化學(xué)發(fā)光猝滅法(ECIQ)［11］、直接電化學(xué)法［12］、毛細(xì)管電泳法(CE)［13］、共振光散射法(RLS)［14］、表面增強(qiáng)拉曼散射法(SERS)［15］。有文獻(xiàn)報(bào)道［16－17］可采用液相色譜熒光檢測(cè)法直接測(cè)定水中的苯胺，但分析時(shí)間較長(zhǎng)且靈敏度不高。對(duì)于比苯胺的地表水環(huán)境質(zhì)量規(guī)定濃度低500倍的痕量聯(lián)苯胺，現(xiàn)有成熟的方法均需經(jīng)過(guò)復(fù)雜的富集濃縮過(guò)程，才能滿足水質(zhì)監(jiān)測(cè)需求。超高壓液相色譜由于采用亞2 μm粒徑填料的色譜柱，可得到比常規(guī)HPLC更快的分離速度和更高的靈敏度［18］，近年來(lái)在環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品藥品分析等領(lǐng)域得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用［19－20］。目前未見(jiàn)關(guān)于超高壓液相色譜熒光檢測(cè)法直接測(cè)定水中苯胺和聯(lián)苯胺的報(bào)道。

本研究建立的直接進(jìn)樣/超高壓液相色譜熒光檢測(cè)法，具有操作方便、快速準(zhǔn)確和靈敏度較高的優(yōu)點(diǎn)，適用于水中痕量苯胺和聯(lián)苯胺的快速測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

UPLC H-class超高壓液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，S220pH儀(上海梅特勒－托利多公司)，U-10電導(dǎo)率儀(日本Horiba公司)。苯胺(5.0 g/L，溶于甲醇)、聯(lián)苯胺(2.0 g/L，溶于二氯甲烷)均為美國(guó)AccuStandard公司產(chǎn)品;乙腈(色譜級(jí)，美國(guó)Tedia公司)，甲醇(色譜級(jí)，美國(guó)Kanglin公司)，醋酸銨(純度＞97.0%，美國(guó)Alfa Aesar公司)，實(shí)驗(yàn)用水均為二次去離子水。針式過(guò)濾器(0.22 μm，13 mm內(nèi)徑，材質(zhì)分別為聚醚砜(PES)、尼龍(PA)和聚四氟乙烯(PTFE)，上海安譜公司)，針式過(guò)濾器(0.2 μm，13 mm內(nèi)徑，材質(zhì)為聚丙烯(GHP)，美國(guó)Waters公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

取1 mL水樣，經(jīng)針式過(guò)濾器過(guò)濾，收集到樣品瓶中，待液相色譜分析。水樣的pH值和電導(dǎo)率分別采用“1.1”所列pH儀和電導(dǎo)率儀測(cè)定。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

針式過(guò)濾器為聚四氟乙烯材質(zhì);色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm);流動(dòng)相為乙腈－3.85 g/L醋酸銨(25∶75);流速0.7 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫40℃;熒光檢測(cè)器的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng):苯胺為λex/λem=232 nm/329 nm，聯(lián)苯胺為λex/λem=292 nm/383 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光檢測(cè)條件的選擇

采用液相色譜熒光檢測(cè)器的光譜掃描技術(shù)，分別對(duì)苯胺和聯(lián)苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜進(jìn)行掃描。通過(guò)對(duì)光譜圖進(jìn)行分析，得到苯胺的發(fā)射波長(zhǎng)為329 nm，激發(fā)波長(zhǎng)在232 nm和292 nm各有1峰，其中232 nm處的激發(fā)能量最大;聯(lián)苯胺的發(fā)射波長(zhǎng)為383 nm，激發(fā)波長(zhǎng)僅在292 nm有1峰。最終確定苯胺和聯(lián)苯胺的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)分別為232 nm/329 nm和292 nm/383 nm。

2.2 流動(dòng)相條件的選擇

分別選擇甲醇－水、乙腈－水和乙腈－醋酸銨體系作為流動(dòng)相，考察不同濃度有機(jī)相條件下，苯胺和聯(lián)苯胺的分離效果。為減少苯胺和聯(lián)苯胺的分析時(shí)間，結(jié)合儀器的最高耐壓限制，選擇流速為0.7 mL/min。對(duì)于乙腈－水和甲醇－水的流動(dòng)相體系，確定最佳的流動(dòng)相比例分別為25%乙腈和30%甲醇。圖1比較了30%甲醇－70%水、25%乙腈－75%水和25%乙腈－75%醋酸銨的流動(dòng)相條件下，苯胺和聯(lián)苯胺的分離情況。結(jié)果顯示，3種流動(dòng)相條件下，苯胺和聯(lián)苯胺均在1 min內(nèi)達(dá)到基線分離;后兩種乙腈流動(dòng)相體系下，分析時(shí)間可縮短為0.8 min。對(duì)于聯(lián)苯胺，有機(jī)相為乙腈的兩種體系下，信號(hào)響應(yīng)明顯高于甲醇體系;對(duì)于苯胺，信號(hào)響應(yīng)則略有提高。比較兩種乙腈體系，對(duì)于聯(lián)苯胺，25%乙腈－75%醋酸銨體系下的信號(hào)略高于25%乙腈－75%水體系，而對(duì)于苯胺，兩種體系相差無(wú)幾。

綜上，乙腈作為流動(dòng)相可以縮短分析時(shí)間，并且顯著提高苯胺和聯(lián)苯胺的熒光信號(hào)，因此本研究?jī)?yōu)先選擇乙腈作為流動(dòng)相中的有機(jī)相。由于采用直接進(jìn)樣法，未進(jìn)行樣品前處理，且苯胺和聯(lián)苯胺是弱堿性物質(zhì)，水樣的pH值、電導(dǎo)率等因素很可能會(huì)影響苯胺和聯(lián)苯胺熒光信號(hào)，所以需對(duì)兩種乙腈流動(dòng)相體系(25%乙腈－75%水和25%乙腈－75%醋酸銨)做進(jìn)一步研究。

圖1 不同流動(dòng)相條件下苯胺和聯(lián)苯胺的色譜圖Fig.1 Chromatograms of aniline and benzidine obtained by using different mobile phases

2.3 水樣pH值的影響

為了考察水樣pH值對(duì)分析結(jié)果的影響，采用自來(lái)水(未檢出苯胺和聯(lián)苯胺)配制了質(zhì)量濃度均為50 μg/L的水樣?？疾炝?5%乙腈－75%水(A)和25%乙腈－75%醋酸銨(B)的流動(dòng)相體系下，不同水樣pH值對(duì)苯胺和聯(lián)苯胺回收率的影響(見(jiàn)圖2)。從圖2A可見(jiàn)，對(duì)于25%乙腈－75%水流動(dòng)相體系，苯胺在pH 3.9～11.9的回收率為95%～104%;聯(lián)苯胺在pH 3.9～10.0時(shí)的回收率為92%～100%，但在pH 11.1和pH 11.9時(shí)，其回收率分別達(dá)到144%和169%。從圖2B可以得出，對(duì)于25%乙腈－75%醋酸銨流動(dòng)相體系，在pH 3.9～11.9范圍內(nèi)，苯胺和聯(lián)苯胺的回收率較高且穩(wěn)定，分別在95%～103%和94%～100%之間。

由于苯胺和聯(lián)苯胺的pKa值分別約為4.6［21］和4.3［22］，在不同pH值的水溶液中，兩種物質(zhì)可分別以兩種狀態(tài)存在:分子狀態(tài)和帶正電荷的離子狀態(tài)。對(duì)于苯胺，不同pH值的水樣中，兩種狀態(tài)的熒光信號(hào)幾乎無(wú)差別。而對(duì)于聯(lián)苯胺，當(dāng)水樣pH值增加到一定數(shù)值后，相應(yīng)的熒光信號(hào)不穩(wěn)定，導(dǎo)致分析結(jié)果不穩(wěn)定。通過(guò)在流動(dòng)相中加入醋酸銨緩沖液，使聯(lián)苯胺主要以離子狀態(tài)穩(wěn)定存在，克服由于水樣pH值變化而引起熒光信號(hào)變化的問(wèn)題，增強(qiáng)其熒光信號(hào)的穩(wěn)定性，提高分析測(cè)試的可靠性和準(zhǔn)確性。圖2顯示25%乙腈－75%醋酸銨的流動(dòng)相具有良好的緩沖能力，對(duì)于一般的環(huán)境樣品前處理，可不調(diào)pH值，以避免對(duì)苯胺和聯(lián)苯胺的濃度產(chǎn)生影響，保證分析的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。

圖2 不同pH值對(duì)苯胺和聯(lián)苯胺回收率的影響Fig.2 Effect of different pH values on recoveries of aniline and benzidine mobile phase:A.25%acetonitrile －75%H2O，B.25%acetonitrile－75%ammonium acetate

2.4 水樣電導(dǎo)率的影響

為了考察水樣電導(dǎo)率對(duì)分析結(jié)果的影響，采用不同稀釋倍數(shù)的自來(lái)水，配制了電導(dǎo)率不同但質(zhì)量濃度均為100 μg/L的水樣。25%乙腈－75%水(A)和25%乙腈－75%醋酸銨(B)的流動(dòng)相體系下，水樣不同電導(dǎo)率對(duì)苯胺和聯(lián)苯胺回收率的影響見(jiàn)圖3。從圖3A可以得出，對(duì)于25%乙腈－75%水的流動(dòng)相體系，在不同電導(dǎo)率條件下，苯胺具有良好的回收率(95%～103%);而對(duì)于聯(lián)苯胺，隨著電導(dǎo)率的增加，其回收率逐漸增加，電導(dǎo)率為0.315 mS/cm后，回收率穩(wěn)定在97%～101%之間。從圖3B可以得出，對(duì)于25%乙腈－75%醋酸銨的流動(dòng)相體系，在不同電導(dǎo)率條件下，苯胺和聯(lián)苯胺均具有良好的回收率，分別在100%～104%和99%～102%之間。這說(shuō)明25%乙腈－75%醋酸銨具有較寬的電導(dǎo)率耐受范圍，對(duì)于一般的環(huán)境樣品前處理，水樣的電導(dǎo)率對(duì)分析結(jié)果幾乎無(wú)影響。因此，實(shí)驗(yàn)最終選用25%乙腈－75%醋酸銨為最佳流動(dòng)相。

圖3 不同電導(dǎo)率值對(duì)苯胺和聯(lián)苯胺回收率的影響Fig.3 Effect of different conductivity values on recoveries of aniline and benzidine mobile phase:A.25%acetonitrile－75%H2O，B.25%acetonitrile－75%ammonium acetate

2.5 前處理方法的選擇

用自來(lái)水和一定體積甲醇或乙腈配制100 μg/L的苯胺和聯(lián)苯胺混合溶液，考察不同前處理方法的回收率。比較了4種膜材質(zhì)(PES、PA、PTFE和GHP膜)針式過(guò)濾器過(guò)濾、5種溶劑(水、10%乙腈、20%乙腈、10%甲醇和20%甲醇)的效果，結(jié)果如圖4所示。圖4A顯示，對(duì)于苯胺，3種膜材質(zhì)(PA、PTFE和GHP膜)過(guò)濾器在5種溶劑下的回收率均較高，在90%～104%之間，能滿足分析要求;而PES濾膜在含有機(jī)相的溶劑下的回收率異常升高，可能是由于溶劑中的有機(jī)成分(乙腈或甲醇)將PES膜上的一些組成物質(zhì)溶解，該類物質(zhì)對(duì)苯胺的熒光信號(hào)具有顯著增強(qiáng)效應(yīng)。圖4B顯示，對(duì)于聯(lián)苯胺，2種膜材質(zhì)(PA和PTFE膜)過(guò)濾器在5種溶劑下的回收率較高，在101%～116%之間，能滿足分析要求;其余2種膜材質(zhì)(PES和GHP膜)在5種溶劑下的回收率偏低，可能是由于膜上的吸附作用降低了聯(lián)苯胺的回收率。另外，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PA膜過(guò)濾器有時(shí)會(huì)析出熒光雜質(zhì)，對(duì)分析結(jié)果存在一定干擾。綜合考慮，選擇不向水樣中加入任何有機(jī)溶劑，采用PTFE膜過(guò)濾器直接進(jìn)行水樣過(guò)濾。

圖4 采用4種膜材質(zhì)過(guò)濾器和5種溶劑進(jìn)行前處理時(shí)苯胺(A)和聯(lián)苯胺(B)(濃度均為100 μg/L)的回收率Fig.4 Recoveries of added 100 μg/L aniline(A)and 100 μg/L benzidine(B)with four types of filters and five kinds of solvents in the pretreatment

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線、靈敏度及精密度

以自來(lái)水(未檢出苯胺和聯(lián)苯胺)配制6個(gè)不同質(zhì)量濃度(1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/L)的苯胺和聯(lián)苯胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，將熒光信號(hào)(峰面積)和質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性系數(shù)(見(jiàn)表1)。結(jié)果表明，苯胺和聯(lián)苯胺在1.0～100.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性系數(shù)(r)達(dá)到0.999以上。對(duì)10.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在相同條件下連續(xù)分析10次，苯胺和聯(lián)苯胺峰面積的RSD分別為0.4%和0.5%，滿足儀器精密度要求。

配制0.2 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本方法進(jìn)行前處理和分析，分別以3倍和10倍信噪比(S/N)計(jì)算方法的檢出限和定量下限。由表1可見(jiàn)，苯胺和聯(lián)苯胺的檢出限分別為0.023、0.024 μg/L，定量下限分別為0.078、0.079 μg/L，均低于GB 3838－2002規(guī)定的控制標(biāo)準(zhǔn)值，因此本方法可滿足水質(zhì)監(jiān)測(cè)的分析要求。

表1 苯胺和聯(lián)苯胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量下限Table 1 Standard curves，correlation coefficients(r)，linear ranges，detection limits and quantitative limits of aniline and benzidine

2.7 方法的加標(biāo)回收率

采用某飲用水水源地(未檢出苯胺和聯(lián)苯胺)的水樣分別配制不同濃度的苯胺和聯(lián)苯胺溶液，考察實(shí)際水樣中方法的加標(biāo)回收率。苯胺和聯(lián)苯胺的加標(biāo)濃度、實(shí)測(cè)值和回收率如表2所示。由表2可見(jiàn)，4種加標(biāo)濃度下，苯胺和聯(lián)苯胺的回收率在86%～106%之間，說(shuō)明方法有較好的回收率，可滿足分析檢測(cè)的要求。

表2 水樣中苯胺和聯(lián)苯胺的分析結(jié)果和回收率Table 2 Analysis results and recovery rate of aniline and benzidine in water

2.8 方法的優(yōu)越性與局限性

本方法無(wú)需繁瑣的前處理過(guò)程，即取得較高的靈敏度，而且分析時(shí)間僅為0.8 min，可顯著提高工作效率。與其他方法比較(如表3所示)，本方法具有較明顯的優(yōu)勢(shì)，如:NEAP法只能測(cè)定苯胺類化合物的總量，不能對(duì)單個(gè)苯胺類化合物進(jìn)行定性和定量分析;HPLC/UV、HPLC/EC、GC－MS和SFC－UV方法由于儀器靈敏度較低，均需對(duì)水樣進(jìn)行繁瑣的富集濃縮過(guò)程。ECIQ法可直接檢測(cè)水樣，但其對(duì)聯(lián)苯胺的檢測(cè)靈敏度不能滿足水質(zhì)分析要求。電極法、EC、CE、RLS和SERS可直接分析水中的苯胺或聯(lián)苯胺，且靈敏度較高，但由于對(duì)應(yīng)的儀器方法并不常見(jiàn)，在水質(zhì)分析部門(mén)的普及率較低，不利于方法推廣與使用。與常規(guī)HPLC/FD相比，本方法擴(kuò)展至聯(lián)苯胺的分析，顯著提高了靈敏度，而且流速低，可減少流動(dòng)相的消耗。本方法的局限性在于:雖然苯胺類物質(zhì)熒光信號(hào)的選擇性和超高壓液相色譜的強(qiáng)大分離能力，在較大程度上可將分析物和雜質(zhì)分離，但僅靠保留時(shí)間定性，仍可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，此時(shí)需要采用不同色譜柱進(jìn)一步加以確認(rèn)。

表3 水中苯胺和聯(lián)苯胺的分析方法比較Table 3 Comparison of various analysis methods of aniline and benzidine in water

(續(xù)表3)

2.9 實(shí)際水樣分析

采集某飲用水水源地、引水渠、淡水湖和咸水湖的水樣，4個(gè)水樣的pH值在7.7～8.9之間，除咸水湖水樣的電導(dǎo)率較高(達(dá)18.1 mS/cm)外，其余水樣的電導(dǎo)在0.324～0.477 mS/cm之間。按照本方法對(duì)4個(gè)水樣進(jìn)行分析，同時(shí)加入低濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.0 μg/L)進(jìn)行加標(biāo)分析。結(jié)果顯示，4種不同類型水樣中均未檢出苯胺和聯(lián)苯胺，對(duì)應(yīng)的低濃度加標(biāo)回收率較高，分別為苯胺88%～107%，聯(lián)苯胺:90%～99%(見(jiàn)表4)。結(jié)果表明，本方法適用于多種類型地表水體中苯胺和聯(lián)苯胺的快速檢測(cè)。

表4 4種水樣的pH值、電導(dǎo)率以及在加標(biāo)濃度為2.0 μg/L下苯胺和聯(lián)苯胺的回收率Table 4 pH values，conductivity values and recoveries(spiked 2.0 μg/L)of aniline and benzidine in four kinds of water samples

3 結(jié)論

采用直接進(jìn)樣/超高壓液相色譜熒光檢測(cè)法，成功地進(jìn)行了多種類型地表水體中苯胺和聯(lián)苯胺的快速分析。該方法與已報(bào)道的方法相比，無(wú)需繁瑣的前處理濃縮過(guò)程，具有操作簡(jiǎn)單、方法檢出限低、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，滿足水質(zhì)監(jiān)測(cè)的需求。有望用于分析其他具有熒光信號(hào)的芳香胺類物質(zhì)。

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