固相萃取-高效液相色譜法測定牛奶中的三聚氰胺

陳丕英 耿勛 （山東省青島市飼料獸藥檢測站 266071）

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固相萃取-高效液相色譜法測定牛奶中的三聚氰胺

陳丕英 耿勛 （山東省青島市飼料獸藥檢測站 266071）

本文建立了牛奶中三聚氰胺的固相萃取-高效液相色譜檢測方法，經(jīng)陽離子交換固相萃取柱凈化后的樣品采用高效液相色譜法測定。結(jié)果表明，三聚氰胺的標準曲線為y=44771.2x+4563.8，相關(guān)系數(shù)r=0.9995，檢測限為0.05mg/kg?；厥章蕿?7.6%～100.4%。該方法操作簡單，精密度和回收率高，可滿足奶粉中三聚氰胺的準確定性和定量測定要求。

牛乳 三聚氰胺 固相萃取 高效液相色譜法

2008年9月，我國發(fā)生了嚴重的牛奶中加入三聚氰胺的“三鹿事件”，隨后在液態(tài)奶、奶糖、雪糕等制品中也相繼檢測出三聚氰胺。三聚氰胺是一種有機含氮雜環(huán)化合物，為重要的化工原料，有良好的絕緣性能和機械輕度，是木材、涂料、造紙、紡織、皮革電器等不可缺少的原料。由于蛋白質(zhì)主要由氨基酸組成，食品中蛋白質(zhì)測試方法常采用凱氏定氮法測定總氮來估算蛋白質(zhì)含量。這種方法只能測定氮的總量，不能識別氮的來源和氮源的種類。三聚氰胺白色粉末，無味，摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)，常被不法商人用作食品添加劑，以冒充食品中的蛋白質(zhì)，每100g牛奶中添加0.1g三聚氰胺，就能提高0.4%蛋白質(zhì)，因此三聚氰胺也被人稱為"蛋白精"。

三聚氰胺被攝入人體內(nèi)遇到胃酸時會溶解，但是排到尿中會再次結(jié)合形成結(jié)晶，可能堵塞腎小管，隨著結(jié)晶在體內(nèi)含量的增多，如果不能排除，積累到一定的程度后形成結(jié)石，給腎功能帶來極大的損害甚至腎衰竭而死亡。蛋白精給奶制品業(yè)帶來了巨大的沖擊。衛(wèi)生部等5部門關(guān)于三聚氰胺在食品中的限量值的公告(衛(wèi)生部公告2011年第10號)要求，嬰兒配方食品中三聚氰胺的限量值為1mg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量值為2.5mg/kg。

目前，三聚氰胺的檢測方法主要有：液相色譜法(HPLC)[2]、液相色譜－質(zhì)譜法(HPLC-MS)[3]、氣相色譜－質(zhì)譜法(GC-MS)[4、5]、毛細管電泳法(CE)、膠體金免疫層析法和酶聯(lián)免疫法等。2008年10月，國家標準(GB/T22400－2008)中又規(guī)定了液相色譜法作為快速檢測原料乳及不含添加物的液態(tài)乳制品中三聚氰胺的方法[6]。本文采用固相萃取-高效液相色譜法（SPE-HPLC）測定牛奶中三聚氰胺的含量，利用了HPLC中紫外可見檢測器的高靈敏度的特點測定低含量成份，測定時間約為10min，操作簡便、靈敏、結(jié)果準確。

1 材料與方法

1.1 試劑 色譜純：甲醇、乙腈、辛烷磺酸鈉。分析純：三氯乙酸、檸檬酸、氨化甲醇、檸檬酸。離子對試劑緩沖液：準確稱取2.10g檸檬酸和2.16g辛烷磺酸鈉，加入約980ml水溶解，調(diào)節(jié)pH至3.0后，定容至1L備用。三聚氰胺標準儲備液：稱取三聚氰胺標準品0.1g，置于100ml容量瓶中，用水溶解，稀釋至刻度，得1000μg·ml－1標準儲備液，于4℃避光保存。

1.2 材料 試驗所用乳制品為超市購的生乳。

1.3 儀器 高效液相色譜儀(美國water公司)；分析天平；高速冷凍離心機(Heraeus公司)；超聲波清洗機(昆山超聲儀器公司)；固相萃取裝置；QSC-12T氮氣吹干儀；渦旋混合器；其它為常規(guī)玻璃儀器。

1.4 色譜條件 色譜柱：C18柱，250mm×4.6mm(i.d.)，5μm；流動相：C18柱，離子對試劑緩沖液-乙腈(90+10，體積比)，混勻；流速0.8ml/min；柱溫40℃；波長240nm；進樣量10μl。

1.5 樣品的制備 稱取新鮮牛乳5g，加入20ml0.1%三氯乙酸提取液，充分混勻，加入5ml2%乙酸鉛溶液，均質(zhì)(2min)或超聲20min，10000rpm/min離心10min，取上清液5ml過混合型陽離子交換小柱(PCX)。待樣液完全流出后分別用3ml甲醇和3ml水活化固相萃取柱，取上述提取液5ml過固相萃取柱，使提取液以不低于1ml/min的流速通過；分別用3ml水和3ml甲醇淋洗固相萃取柱，棄去淋洗液并將小柱抽干。用5ml5%氨化甲醇(v/v，5ml氨水+95ml甲醇)洗脫，收集洗脫液于試管中在50℃下，用氮氣吹干，流動相定容至1ml，過0.2μm濾膜，上機測定。

1.6 標準曲線 移取三聚氰胺標準儲備液用乙腈逐級稀釋得到的濃度為0.5、1.0、5.0、10、20μg/ml的標準工作液，分別進行高效液相色譜測定，繪制標準曲線。

1.7 樣品測定 將生乳樣品經(jīng)1.4處理后在色譜條件下進行分析，測定其峰面積，然后在標準曲線上測定三聚氰胺的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖

在1.3色譜條件下，得到的三聚氰胺標準樣品的色譜圖，見圖1，走樣時間為5min，標準樣品保留時間為2min 50s左右。

圖1 標準樣品色譜圖

2.2 標準曲線的繪制與檢測限 各種濃度的三聚氰胺工作液高效液相色譜分析結(jié)果見表1，以三聚氰胺濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，如圖2所示。得到標準曲線回歸方程：y=44771.2x+4563.8，相關(guān)系數(shù)r=0.9995。結(jié)果表明，三聚氰胺在0.5～20μg/ml的濃度范圍呈良好的線性關(guān)系。在選定色譜條件下，測定三聚氰胺的檢測限，結(jié)果表明檢測限為0.05mg/kg。

表1 不同濃度三聚氰胺標準溶液的峰面積

圖2 標準曲線

2.3 精密度和回收率試驗 在選定條件下加入3個不同濃度的牛奶三聚氰胺測定添加回收率，每個樣品重復測定5次，計算精密度(見表2)?；厥章史秶鸀?7.6%~100.4%，相對標準偏差為0.56%~1.12%。

表2 回收率的測定 (mg/kg、%)

2.4 樣品檢測結(jié)果 對從市場購買的四個不同品牌的牛奶用建立好的高效液相色譜法進行檢測，測得的結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，4個不同品牌牛奶中所含的三聚氰胺含量均符合國家限量標準。

表3 不同樣品中三聚氰胺的測定結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立了固相萃取-高效液相色譜法測定牛奶中的三聚氰胺的線性方程，相關(guān)系數(shù)為0.9995，回收率范圍為97.6%~100.4%，相對標準偏差為0.56%~1.12%。該法操作簡便、靈敏度和精密度高、檢測線性范圍寬、回收率穩(wěn)定，適用于奶站、乳品廠和實驗室的快速篩選檢測。

[1] 衛(wèi)生部，工業(yè)和信息化部，農(nóng)業(yè)部，工商總局，質(zhì)檢總局．2008年第25號(關(guān)于乳與乳制品中三聚氰胺臨時管理限量值規(guī)定的公告) [EB/OL]. http://www.moh.gov.en/publicfiles/business/htmlfiles/mohwsjdj/s789/200810/38033. htm.

[2] 王煉, 龐晶晶, 余輝菊. 超高效液相色譜法測定乳及乳制品中的三聚氰胺[J]. 分析試驗室, 2010, 29(4): 53-55.

[3] 胡陽, 倪輝, 吳光斌等. 高效液相色譜法測定乳制品中三聚氰胺的含量[J]. 集美大學學報(自然科學版), 2010, 15(l): 36-38.

[4] 宗珊盈, 王毅紅, 王楠等. 超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法測定乳制品中三聚氰胺的殘留量[J]. 分析試驗室, 2009, 28(5): 85-87.

[5] Ibaneza M, SanehoJ V, Hemandez F.Determinationofmelamine in milk-based products and other food and beverage produets by ionpair liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta, 2009, 649(l): 91-97.

[6] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局, 中國國家標準化管理委員會. 原料乳與乳制品中三聚氰胺的檢測方法(GB/T 22388-2008)[S]. 北京:中國標準出版社, 2008.

（2012–12–21）

S859.84

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1007-1733(2013)01-0029-02