• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    VmaH和PMA在指狀青霉中的表達(dá)及其作為潛在殺菌作用靶點(diǎn)的可能性

    2021-03-31 02:01:10彭麗桃楊書珍
    食品科學(xué) 2021年6期
    關(guān)鍵詞:指狀青霉侵染

    范 明,彭麗桃,閆 等,范 剛,楊書珍,李 杰

    (華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖北 武漢 430070)

    由指狀青霉(Penicillium digitatum)侵染導(dǎo)致的柑橘綠霉病是引起采后柑橘腐敗變質(zhì)的重要原因。據(jù)統(tǒng)計(jì),約有90%的腐爛柑橘果實(shí)是由于被指狀青霉侵染所致,經(jīng)濟(jì)損失巨大[1]。目前,化學(xué)殺菌劑處理仍是控制柑橘采后貯運(yùn)病害的重要手段,但化學(xué)殺菌劑的長期大量使用使得病原真菌的抗藥性日益增強(qiáng),殺菌劑的使用周期顯著縮短[2-4]。因此,研究與開發(fā)具有新型藥物作用靶點(diǎn)的殺菌劑對柑橘采后安全生產(chǎn)具有十分重要的意義。

    酸堿平衡是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、保證細(xì)胞正常代謝與功能的前提[5]。為了適應(yīng)更多極端的生長和侵染環(huán)境,真菌細(xì)胞較其他真核生物具有更強(qiáng)大的pH值調(diào)控和H+轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[6]。其中V型ATP酶質(zhì)子泵(vacuolar H+-ATPase,V-ATPase)和P型質(zhì)子泵(plasma membrane H+-ATPase,P-ATPase)在保持細(xì)胞內(nèi)的pH值動(dòng)態(tài)平衡和建立細(xì)胞膜內(nèi)外的質(zhì)子梯度中起著關(guān)鍵作用[7-9]。在球孢白僵菌的研究中發(fā)現(xiàn)V-ATPase功能的缺失導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)pH值和鈣離子的失衡,從而影響了真菌細(xì)胞骨架的維持[6]。對白色念珠菌的研究表明[10],編碼V-ATPase亞基的基因缺失會(huì)導(dǎo)致菌株毒力降低。Billack等[11]研究也發(fā)現(xiàn)P-ATPase在白色念珠菌致病力上具有重要作用。因此,V-ATPase和P-ATPase在真菌細(xì)胞生命活動(dòng)和對寄主的侵染過程中發(fā)揮著重要作用。

    VmaH(vacuolar ATP synthase subunit H)基因所編碼的蛋白是V-ATPase的一個(gè)關(guān)鍵亞基,它不但調(diào)控復(fù)合體V1和V0的組裝,而且還通過調(diào)控ATP(水解ATP)活性而調(diào)控H+跨膜運(yùn)輸[12]。Rizzo等[13]研究表明VmaH基因表達(dá)水平的差異會(huì)影響V-ATPase的組裝。VmaH基因的缺失會(huì)導(dǎo)致害蟲的死亡和真菌侵染毒力的下降[14-15]。PMA1(plasma membrane ATPase 1)是編碼P-ATPase的主要基因,位于細(xì)胞質(zhì)膜上,主要是產(chǎn)生電化學(xué)梯度,把細(xì)胞內(nèi)的H+泵出膜外,驅(qū)動(dòng)一定數(shù)量的次級跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),促進(jìn)離子和代謝物的吸收;同時(shí)P-ATPase有助于保持細(xì)胞內(nèi)pH值的調(diào)節(jié),維持細(xì)胞內(nèi)pH值的相對穩(wěn)定,從而保證各種生命活動(dòng)的正常運(yùn)行[16]。Morsomme等[17]研究表明,PMA缺陷型真菌突變體的許多生理活動(dòng)不能正常進(jìn)行,生長幾乎停止。但目前有關(guān)VmaH和PMA的研究主要集中在植物[18-19]、酵母菌[6,14]和其他少量真菌上,對于植物病原真菌尤其是柑橘綠霉病菌中VmaH和PMA基因的研究尚鮮見報(bào)道。本研究在利用生物信息學(xué)分析VmaH和PMA基因的基礎(chǔ)上,采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)技術(shù)分析VmaH和PMA在柑橘綠霉病菌中的表達(dá)規(guī)律,進(jìn)一步探討VmaH和PMA作為抑制柑橘綠霉病的藥物作用靶點(diǎn)的可行性,以期為研發(fā)適合柑橘采后病害控制的新型、安全、高效的柑橘采后殺菌劑提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    指狀青霉菌株(菌株編號:DSM62840),購自德國微生物菌種保藏中心。

    馬鈴薯蔗糖瓊脂(potato saccharose agar,PSA)培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,加入1 L蒸餾水,煮沸后取濾液加入蔗糖10 g,瓊脂20 g。馬鈴薯蔗糖肉湯(potato saccharose broth,PSB)培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,加入1 L蒸餾水,煮沸后取濾液加入蔗糖10 g。

    柱式真菌總RNA抽提純化試劑盒、柱式植物總RNA抽提純化試劑盒 生工生物工程(上海)股份有限公司;HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒 南京諾唯贊生物科技有限公司;松屬素、香芹酚、辛烯醛阿拉丁試劑(上海)有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    qTOWER2.2實(shí)時(shí)定量PCR儀 德國耶拿分析儀器股份有限公司;Gel Doc XR+凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司;SPX-150BIII生化培養(yǎng)箱 北京鑫潤科諾儀器儀表有限公司;SHZ-82A氣浴恒溫振蕩箱 金壇市宏華儀器廠;YXQ-LS-18SI手提式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;LGJ-10冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1VmaH和PMA基因生物信息學(xué)分析

    在NCBI網(wǎng)站上下載指狀青霉VmaH(GenBank:AKCT01000068.1)和PMA(GenBank:JH993691.1)氨基酸和蛋白序列。利用BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中的基因序列進(jìn)行同源性比對。利用Pfam在線預(yù)測軟件(http://pfam.janelia.org/search)對指狀青霉VmaH和PMA結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)多序列比對采用DNAMAN 8.0程序。系統(tǒng)進(jìn)化分析利用MEGA程序(版本號5.02)中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

    1.3.2 引物設(shè)計(jì)

    參照NCBI上已發(fā)布的指狀青霉VmaH和PMA基因的mRNA保守區(qū)序列設(shè)計(jì)real-time PCR引物,所涉及引物均由天一輝遠(yuǎn)有限公司合成(表1)。

    表 1 PCR擴(kuò)增所用引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR amplification

    1.3.3VmaH和PMA基因表達(dá)規(guī)律分析

    1.3.3.1 菌齡對指狀青霉生長過程中VmaH和PMA基因表達(dá)的影響

    取在PSA培養(yǎng)基上26 ℃培養(yǎng)3 d的指狀青霉孢子,制成1×106CFU/mL孢子菌懸液,取200 μL涂布于含玻璃紙的PSA培養(yǎng)基上,于26 ℃培養(yǎng),分別取培養(yǎng)2、3、4、5、6、7、8 d和14 d的菌絲,液氮速凍后-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.3.2 指狀青霉侵染臍橙過程中VmaH和PMA的基因表達(dá)

    新鮮臍橙在0.2%(體積分?jǐn)?shù))次氯酸鈉溶液中浸泡2 min,用蒸餾水沖洗2 次并晾干。使用接種針在果實(shí)腰部造傷,深度約3 mm。將長勢一致的指狀青霉菌絲餅反貼至果實(shí)傷口處。將果實(shí)放置于26 ℃環(huán)境下,分別于第5、6、7、8、9、15天收集病健部組織,液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.3.3 酸堿處理對指狀青霉菌絲抑制率和VmaH、PMA基因表達(dá)的影響

    取在PSA培養(yǎng)基上26 ℃培養(yǎng)3 d的指狀青霉孢子,制成1×106CFU/mL孢子菌懸液,取200 μL于PSB培養(yǎng)基中,于 26 ℃恒溫?fù)u床中120 r/min培養(yǎng)2 d,紗布過濾,無菌水沖洗3 次。稱取1.60 g濕菌絲,移至pH值分別為2、4、6、8、10、12的PSB培養(yǎng)基中脅迫24 h。用1 mol/L NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)PSB培養(yǎng)基pH值至2、4、6、8、10、12,以pH 6 PSB培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲作空白對照。處理過程結(jié)束后,用于RNA提取的樣品收集菌絲液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆?,用于測定菌絲抑制率的樣品冷凍干燥48 h后稱量干質(zhì)量,并按下式計(jì)算各處理組的菌絲抑制率:

    1.3.3.4 葡萄糖饑餓和回補(bǔ)對指狀青霉VmaH和PMA基因表達(dá)的影響

    取在PSA培養(yǎng)基上26 ℃培養(yǎng)3 d的指狀青霉孢子,制成1×106CFU/mL孢子菌懸液,取200 μL于PSB培養(yǎng)基中,于26 ℃恒溫?fù)u床中120 r/min培養(yǎng)2 d,紗布過濾,無菌水沖洗3 次。取8.00 g濕菌絲于500 mL錐形瓶中,加入300 mL 50 mmol/L KCl溶液,4 ℃饑餓24 h,收集菌絲液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆?。取饑餓24 h的菌體過濾,無菌水沖洗3 次,取1.00 g濕菌絲重懸于20 mL 10 g/100 mL葡萄糖溶液中,處理10、20、30、40、50 min及60 min。處理過程結(jié)束后,收集菌絲液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.3.5 不同殺菌物質(zhì)和氧化還原劑對指狀青霉菌絲抑制率和VmaH、PMA基因表達(dá)的影響

    取在PSA培養(yǎng)基上26 ℃培養(yǎng)3 d的指狀青霉孢子,制成1×106CFU/mL孢子菌懸液,取200 μL于PSB培養(yǎng)基中,于26 ℃恒溫?fù)u床中120 r/min培養(yǎng)2 d,紗布過濾,無菌水沖洗3 次。稱取1.60 g濕菌絲,分別加入50 mL PSB培養(yǎng)基、50 mL含200 μL乙醇的PSB培養(yǎng)基、50 mL含37.5 μL乙醇的PSB培養(yǎng)基、50 mL含20 μL DMSO的PSB培養(yǎng)基和50 mL含不同濃度松屬素、聯(lián)苯芐唑、香芹酚、辛烯醛、H2O2、Na2SO3的PSB培養(yǎng)基中脅迫處理24 h,處理過程結(jié)束后,用于RNA提取的樣品液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆茫糜跍y定菌絲抑制率的樣品冷凍干燥48 h后稱量干質(zhì)量,計(jì)算各處理組的菌絲抑制率。其中50 mL PSB培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲作為空白對照(CK1),50 mL含200 μL乙醇、37.5 μL乙醇、20 μL DMSO的PSB培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲作為溶劑對照組(CK2)。松屬素、香芹酚、辛烯醛用乙醇分別配成20%松屬素、105μL/L香芹酚、辛烯醛的母液,聯(lián)苯芐唑用DMSO配成0.032 g/mL母液。

    以指狀青霉肌動(dòng)蛋白基因(β-actin)作為內(nèi)參基因,檢測在不同條件下VmaH和PMA在轉(zhuǎn)錄水平上的相對表達(dá)量。

    提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄后通過real-time PCR檢測VmaH和PMA的表達(dá)水平。real-time PCR體系為:SYBR Green PCR Master Mix 5 μL,不同樣本的cDNA 1 μL,10 μmoL/L上下游引物(β-actin引物:actin-F/R;VmaH引物:Q-VmaH-F/R,PMA引物:Q-PMA-F/R,序列見表1)1 μL,雙蒸水補(bǔ)足體積至10 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃延伸30 s,40 個(gè)循環(huán)收集熒光信號。每個(gè)樣品3 次重復(fù),采用2-??Ct公式進(jìn)行計(jì)算。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    用Excel 2007軟件進(jìn)行平均值、標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算和圖形繪制,所有數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)所得,采用SPSS 22軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,應(yīng)用最小顯著差數(shù)法檢驗(yàn)差異顯著性(P<0.05,差異顯著)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 VmaH和PMA結(jié)構(gòu)域、同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析

    圖 1 指狀青霉與其他物種VmaH的多序列比對Fig. 1 Multiple sequence alignment of VmaH from P. digitatum and other species

    通過Pfam在線預(yù)測軟件對指狀青霉VmaH和PMA的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)VmaH具有2 個(gè)非常保守的結(jié)構(gòu)域,分別為N端的結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域,N端的結(jié)構(gòu)域位于第7~356個(gè)氨基酸之間,C端結(jié)構(gòu)域位于第357~475個(gè)氨基酸之間;PMA具有3 個(gè)非常保守的結(jié)構(gòu)域,分別為位于N端的結(jié)構(gòu)域、E1-E2 ATPase結(jié)構(gòu)域和水解酶結(jié)構(gòu)域,N端的結(jié)構(gòu)域位于第84~141個(gè)氨基酸之間,E1-E2 ATPase結(jié)構(gòu)域位于第182~406個(gè)氨基酸之間,水解酶結(jié)構(gòu)域位于第422~689個(gè)氨基酸之間。有研究表明,酵母中VmaH的N末端域是激活A(yù)TP水解所必需的,而C末端域是適當(dāng)?shù)哪芰狂詈纤匦璧腫20]。PMA中N末端在膜內(nèi)側(cè)構(gòu)成H+入口,水解酶結(jié)構(gòu)域控制ATP的水解,E1-E2 ATPase結(jié)構(gòu)域通過構(gòu)象循環(huán)變化實(shí)現(xiàn)離子運(yùn)輸,E1對輸出的離子有很高親和力,E2對輸入的離子有很高親和力[21]。

    圖 2 指狀青霉與其他物種PMA的多序列比對Fig. 2 Multiple sequence alignment of PMA from P. digitatum and other species

    將氨基酸序列進(jìn)行BLASTp比對分析,用DNAMAN 8.0軟件對指狀青霉VmaH和PMA與其他物種的VmaH和PMA進(jìn)行同源性比對,結(jié)果如圖1、2所示,對比結(jié)果發(fā)現(xiàn),指狀青霉VmaH與擴(kuò)展青霉、曲霉、大觀貝氏菌、酵母菌的VmaH同源性較高,其相似度達(dá)到79%以上,指狀青霉PMA(JH993691.1)與擴(kuò)展青霉、曲霉、黃萎病菌等真菌PMA1的相似度達(dá)到80%以上,表明VmaH和PMA在真菌物種中較為保守。

    用MEGA 5.0軟件采用鄰位相接法(Neighbor Joining)構(gòu)建指狀青霉VmaH和PMA的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3、4)。結(jié)果表明,指狀青霉VmaH與青霉屬、大觀貝氏菌序列具有最高的同源性,與曲霉屬的VmaH蛋白高度同源;指狀青霉PMA與日本曲霉、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)序列具有最高的同源性,與青霉屬、木霉屬、小麥酵母等的PMA蛋白高度同源。表明VmaH和PMA基因的氨基酸序列在真菌中具有較高的保守性,親緣關(guān)系較近。

    圖 3 指狀青霉與其他物種VmaH的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of VmaH from P. digitatum and other species

    圖 4 指狀青霉與其他物種PMA的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of PMA from P. digitatum and other species

    2.2 指狀青霉生長和侵染過程中VmaH和PMA基因表達(dá)

    如圖5所示,與PMA相比,VmaH相對表達(dá)量在指狀青霉菌絲生長和侵染臍橙果實(shí)的整個(gè)過程中變化較為平緩,僅在生長和侵染后期表達(dá)量有一定程度的升高。而PMA在菌絲生長和侵染臍橙前期穩(wěn)定表達(dá),中期開始表達(dá)量顯著下調(diào)。推測在指狀青霉生長和侵染臍橙前期,VmaH和PMA共同維持指狀青霉生長所需的胞內(nèi)外pH值,而在中后期主要是由VmaH維持指狀青霉生長所需的酸性平衡。

    圖 5 VmaH和PMA在指狀青霉生長(A)和侵染(B)過程中定量表達(dá)分析Fig. 5 Quantitative expression analysis of VmaH and PMA during the growth (A) and infection (B) of P. digitatum

    2.3 不同酸堿處理對指狀青霉菌絲生長和VmaH、PMA表達(dá)的影響

    圖 6 VmaH和PMA在不同pH值下定量表達(dá)和抑菌率分析Fig. 6 Quantitative expression and antibacterial rate analysis of VmaH and PMA under different pH conditions

    如圖6所示,弱酸和弱堿條件下PMA在調(diào)節(jié)胞內(nèi)外pH值上發(fā)揮著主要作用;而在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下VmaH和PMA的功能均受到抑制,尤其在極堿條件下VmaH和PMA調(diào)控胞內(nèi)外pH值的能力減弱,菌絲無法正常生長。

    2.4 葡萄糖饑餓以及回補(bǔ)條件對指狀青霉VmaH和PMA表達(dá)的影響

    如圖7所示,葡萄糖饑餓會(huì)使VmaH和PMA基因的表達(dá)量顯著下調(diào),葡萄糖回補(bǔ)可以恢復(fù)VmaH和PMA基因的表達(dá),且VmaH在回補(bǔ)狀態(tài)下基因表達(dá)量顯著高于PMA基因的表達(dá)量。

    圖 7 VmaH和PMA在葡萄糖饑餓和回補(bǔ)中定量表達(dá)分析Fig. 7 Quantitative expression analysis of VSH and PMA under glucose starvation and supplementation

    2.5 氧化還原劑對指狀青霉菌絲抑制率和VmaH、PMA表達(dá)的影響

    圖 8 VmaH和PMA在H2O2和Na2SO3脅迫下定量表達(dá)和抑菌率分析Fig. 8 Quantitative expression and antibacterial rate analysis of VmaH and PMA under the stress of H2O2 and Na2SO3

    如圖8所示,H2O2和Na2SO3處理顯著降低了指狀青霉VmaH和PMA的表達(dá)量,且與VmaH相比,PMA對H2O2和Na2SO3處理更敏感??梢钥闯?,隨著VmaH和PMA的表達(dá)的顯著下調(diào),菌絲體的生長受到明顯抑制。

    2.6 殺菌劑處理對指狀青霉菌絲抑制率和VmaH、PMA基因表達(dá)的影響

    如圖9所示,經(jīng)黃酮類化合物松屬素處理后,指狀青霉菌絲生長均被顯著抑制,PMA表達(dá)量在各個(gè)用量下均顯著下調(diào),而VmaH在高濃度時(shí)才會(huì)顯著下調(diào)。經(jīng)細(xì)胞膜抑制劑聯(lián)苯芐唑處理后,指狀青霉菌絲生長量和PMA表達(dá)量均被顯著抑制,且抑制程度隨其質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng),而對VmaH的表達(dá)量影響不顯著。經(jīng)植物香精油香芹酚和辛烯醛處理后,VmaH和PMA相對表達(dá)量均顯著下調(diào),且下調(diào)程度隨其用量增加而增強(qiáng)。VmaH經(jīng)低用量辛烯醛處理后相對表達(dá)量下調(diào)了48%,而經(jīng)低用量香芹酚處理后相對表達(dá)量僅下調(diào)了13%,表明相較于香芹酚,VmaH對辛烯醛響應(yīng)更敏感。在高用量辛烯醛和香芹酚處理下,VmaH相對表達(dá)量分別下調(diào)了53%、49%,PMA相對表達(dá)量均下調(diào)了98%,表明相比于VmaH,PMA對香芹酚和辛烯醛處理更為敏感。

    圖 9 VmaH和PMA在不同類型殺菌劑脅迫下定量表達(dá)和抑菌率分析Fig. 9 Quantitative expression and antibacterial rate analysis of VSH and PMA under the stress of different types of fungicides

    3 討論與結(jié)論

    本研究通過結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)指狀青霉中的VmaH具有2 個(gè)非常保守的結(jié)構(gòu)域,分別為N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域,與酵母VmaH[20]有相同的結(jié)構(gòu)域;PMA具有3 個(gè)非常保守的結(jié)構(gòu)域,分別為位于N端的結(jié)構(gòu)域、E1-E2 ATPase結(jié)構(gòu)域和水解酶結(jié)構(gòu)域,與大多數(shù)真菌[21]PMA結(jié)構(gòu)域相同。表明指狀青霉中的VmaH和PMA與其他真菌中的VmaH和PMA發(fā)揮著同樣的功能。同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)指狀青霉中的VmaH和PMA基因所編碼的蛋白和青霉屬、曲霉屬、酵母等其他種屬具有相同結(jié)構(gòu)域和高度同源性,而與其他植物細(xì)胞和哺乳類動(dòng)物細(xì)胞同源性較低,尤其是PMA編碼的蛋白是真菌特有蛋白,與哺乳動(dòng)物無同源性,表明VmaH和PMA適合作為藥物作用靶點(diǎn)。因此,從生物信息學(xué)方面,VmaH和PMA所編碼的蛋白可以作為真菌特異性藥物作用靶點(diǎn)進(jìn)一步對其功能特性進(jìn)行深入研究。

    研究發(fā)現(xiàn),VmaH功能缺失后會(huì)導(dǎo)致球孢白僵菌侵染毒力下降[6]、釀酒酵母生長狀態(tài)受到影響[14]、東方粘蟲中毒或死亡[12]、東亞飛蝗個(gè)體出現(xiàn)死亡和顯著的蛻皮缺陷表型[15]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[6],VmaH主要通過影響液泡pH值,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外pH值環(huán)境,以致改變其侵染能力。此外,Petrov[22]的研究同樣發(fā)現(xiàn)PMA缺失和PMA定點(diǎn)突變的釀酒酵母突變體泵H+和ATP水解功能均受到抑制,從而導(dǎo)致釀酒酵母生長狀態(tài)受到影響。本研究也發(fā)現(xiàn)VmaH和PMA在指狀青霉菌絲生長和侵染橙子前期均維持較高表達(dá)水平;而在中后期僅VmaH維持較高表達(dá)水平,PMA顯著下調(diào)。表明VmaH和PMA在指狀青霉生長和侵染寄主的前期發(fā)揮著重要作用,尤其VmaH在指狀青霉生長和侵染后期發(fā)揮著重要作用。酸堿平衡與真菌的生長和侵染能力密切相關(guān),VmaH和PMA在調(diào)控真菌細(xì)胞內(nèi)外pH值平衡上具有重要作用。因此,從指狀青霉生長和侵染方面,VmaH和PMA可作為指狀青霉藥物作用靶點(diǎn)進(jìn)一步研究。

    在外界環(huán)境脅迫下,不同基因編碼的蛋白在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過程中發(fā)揮著不同作用。本實(shí)驗(yàn)通過研究在酸堿、葡萄糖以及各種殺菌物質(zhì)的環(huán)境脅迫下VmaH和PMA在指狀青霉中的表達(dá)情況,分析VmaH和PMA作為指狀青霉酸代謝、碳代謝、氧化還原等方面藥物靶點(diǎn)的可能性。胞外pH值和葡萄糖會(huì)影響V-ATPase和P-ATPase的活性[23],進(jìn)而影響真菌酸堿平衡。研究表明,酵母菌P-ATPase的表達(dá)對酸脅迫敏感,在pH值為2.5時(shí),PMA1的mRNA水平和酶活性顯著下降[24],而弱酸條件可增加真菌P-ATPase的活性[25]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在弱酸弱堿環(huán)境中,指狀青霉生長所需的胞內(nèi)外pH值主要是由PMA發(fā)揮作用,而在極酸極堿條件下VmaH和PMA的活性均受到損傷,從而導(dǎo)致指狀青霉無法正常生長,表明其在指狀青霉的酸堿平衡中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Kane[26]研究發(fā)現(xiàn),葡萄糖信號傳導(dǎo)途徑可能介導(dǎo)V-ATPase的拆卸和重新組裝,進(jìn)而影響V-ATPase的活性。在含葡萄糖的培養(yǎng)基中,V-ATPase有55%~70%的V0區(qū)段與V1組裝在一起,但在葡萄糖饑餓后,只有15%~20%的V0區(qū)段與V1結(jié)合,經(jīng)葡萄糖回補(bǔ)后,組裝水平再次為55%~70%。另有研究表明,在葡萄糖饑餓條件下可能導(dǎo)致PMA1和其他ATP驅(qū)動(dòng)的過程直接失活[27],而向酵母細(xì)胞中添加葡萄糖可激活P-ATPase介導(dǎo)的質(zhì)子外排[28]。本研究同樣發(fā)現(xiàn),葡萄糖饑餓顯著降低了VmaH和PMA基因表達(dá)水平,葡萄糖回補(bǔ)可以恢復(fù)兩個(gè)基因的表達(dá)水平,尤其是VmaH相對表達(dá)量顯著上調(diào),表明VmaH和PMA在指狀青霉糖代謝過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。因此,VmaH和PMA可作為酸代謝、碳代謝方面可能性藥物靶點(diǎn)進(jìn)一步研究。

    本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在氧化還原劑以及各種殺菌物質(zhì)脅迫條件下,PMA在各種藥物脅迫下均受到抑制,而VmaH僅在部分藥物脅迫下才會(huì)受到抑制,表明VmaH和PMA是響應(yīng)不同種類藥物的重要作用靶點(diǎn),可以影響氧化還原等方面,對生命活動(dòng)至關(guān)重要,是重要的藥物作用靶點(diǎn),值得深入探討。丁俐文等[29]研究也發(fā)現(xiàn)V-ATPase可作為粘蟲的藥物作用靶點(diǎn),通過苦皮藤素V產(chǎn)生殺蟲效果。過表達(dá)Put VHA-c的轉(zhuǎn)基因酵母具有更高的耐鹽性,表明V-ATPase在逆境脅迫中發(fā)揮重要作用[30]。在銅脅迫下釀酒酵母的質(zhì)膜組織受到破壞從而使P-ATPase的活性降低[31]。Billack等[11]的研究同樣發(fā)現(xiàn)PMA可作為白色念珠菌的藥物作用靶點(diǎn),通過抑制劑如依布硒對真菌生長產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制作用。因此,從VmaH和PMA對不同藥物的響應(yīng)方面,VmaH和PMA有作為指狀青霉藥物作用靶點(diǎn)的可能性。

    綜上所述,VmaH和PMA所編碼的蛋白真菌特異性強(qiáng),參與了指狀青霉生長和侵染寄主的過程,在指狀青霉的酸代謝、糖代謝過程中發(fā)揮著重要作用,對于不同的脅迫環(huán)境響應(yīng)差異顯著,其中PMA對外界環(huán)境脅迫反應(yīng)更為明顯,VmaH在脅迫條件下對細(xì)胞pH值平衡發(fā)揮的作用更顯著。因此,VmaH和PMA作為潛在的抗指狀青霉藥物靶點(diǎn),值得進(jìn)行深入研究和探討。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)為接下來通過基因過表達(dá)、沉默、敲除等手段進(jìn)一步研究VmaH和PMA作為指狀青霉藥物靶點(diǎn)的可能性提供了理論支持。

    猜你喜歡
    指狀青霉侵染
    揭示水霉菌繁殖和侵染過程
    轉(zhuǎn)錄因子PDIDSM_85260對指狀青霉生物學(xué)特性的影響
    獲得性指狀纖維角皮瘤驗(yàn)案
    淺水三角洲前緣指狀砂壩構(gòu)型特征
    ——以渤海灣盆地渤海BZ25油田新近系明化鎮(zhèn)組下段為例
    蕓薹根腫菌侵染過程及影響因子研究
    甘藍(lán)根腫病菌休眠孢子的生物學(xué)特性及侵染寄主的顯微觀察
    碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展
    三種方法聯(lián)合檢測在非HIV感染兒童馬爾尼菲青霉病的臨床應(yīng)用
    產(chǎn)IMP-1型碳青霉烯酶非脫羧勒克菌的分離與鑒定
    拮抗擴(kuò)展青霉菌株的篩選及其抗菌活性物質(zhì)分離
    免费无遮挡裸体视频| 久久性视频一级片| 日日干狠狠操夜夜爽| av视频在线观看入口| 国产精品久久视频播放| 久99久视频精品免费| 国产精品亚洲av一区麻豆| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产精品电影一区二区三区| 免费av不卡在线播放| 国产视频内射| 午夜免费观看网址| 亚洲av中文字字幕乱码综合| av视频在线观看入口| 国产主播在线观看一区二区| 精品不卡国产一区二区三区| 日本熟妇午夜| 久久国产精品影院| 国产极品精品免费视频能看的| 又粗又爽又猛毛片免费看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 色综合亚洲欧美另类图片| avwww免费| 国产高清视频在线观看网站| 嫩草影院精品99| 免费人成视频x8x8入口观看| 色播亚洲综合网| 精品熟女少妇八av免费久了| 又爽又黄无遮挡网站| 在线播放国产精品三级| 久久性视频一级片| 两性夫妻黄色片| 免费在线观看亚洲国产| 色尼玛亚洲综合影院| 国产探花在线观看一区二区| 欧美色欧美亚洲另类二区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产视频内射| 99久国产av精品| 国产视频内射| 国产精品久久电影中文字幕| 久久久精品大字幕| 久久久久免费精品人妻一区二区| 黄色成人免费大全| 不卡一级毛片| 村上凉子中文字幕在线| 久久精品国产清高在天天线| 国产精品日韩av在线免费观看| a级毛片a级免费在线| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲 欧美一区二区三区| h日本视频在线播放| 午夜视频精品福利| 天天添夜夜摸| 成熟少妇高潮喷水视频| 午夜两性在线视频| 黄片小视频在线播放| 久久久久国内视频| 看免费av毛片| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久久精品欧美日韩精品| 免费在线观看亚洲国产| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 夜夜爽天天搞| 日本三级黄在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 99re在线观看精品视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产v大片淫在线免费观看| 免费看光身美女| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲九九香蕉| 精品久久久久久成人av| 欧美日韩黄片免| 国产av不卡久久| 成人性生交大片免费视频hd| 麻豆一二三区av精品| 97碰自拍视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产在线精品亚洲第一网站| 波多野结衣高清无吗| 亚洲av电影在线进入| av片东京热男人的天堂| 国产精品99久久99久久久不卡| 在线永久观看黄色视频| 一本久久中文字幕| 亚洲av成人精品一区久久| 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久伊人香网站| 黄色视频,在线免费观看| 免费观看人在逋| 成人无遮挡网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产黄a三级三级三级人| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 欧美乱妇无乱码| 欧美成人免费av一区二区三区| 怎么达到女性高潮| 色老头精品视频在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 嫁个100分男人电影在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 一本综合久久免费| 此物有八面人人有两片| 国产av不卡久久| 亚洲成av人片免费观看| 日本三级黄在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 日韩免费av在线播放| 黄片小视频在线播放| 丝袜人妻中文字幕| 久久国产精品人妻蜜桃| av天堂中文字幕网| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 成年女人永久免费观看视频| 日韩有码中文字幕| 日日夜夜操网爽| 国产极品精品免费视频能看的| 日韩欧美三级三区| 久久性视频一级片| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 日本黄色视频三级网站网址| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产亚洲欧美98| 韩国av一区二区三区四区| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国模一区二区三区四区视频 | 亚洲国产精品合色在线| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲中文字幕日韩| 久久精品国产清高在天天线| 欧美成人性av电影在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 国产探花在线观看一区二区| 国产视频一区二区在线看| 色噜噜av男人的天堂激情| 欧美日韩乱码在线| 两人在一起打扑克的视频| 成人一区二区视频在线观看| 一个人看视频在线观看www免费 | 国产伦在线观看视频一区| 亚洲精品在线观看二区| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲精品久久国产高清桃花| 午夜久久久久精精品| 无限看片的www在线观看| 午夜福利18| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲成人久久爱视频| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲欧美精品综合久久99| 日韩欧美在线二视频| 午夜日韩欧美国产| 久久国产精品影院| 国产三级在线视频| 在线永久观看黄色视频| 国产精品av久久久久免费| 午夜精品在线福利| 色尼玛亚洲综合影院| 天天一区二区日本电影三级| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 99精品欧美一区二区三区四区| 母亲3免费完整高清在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 日本一本二区三区精品| 757午夜福利合集在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 又黄又粗又硬又大视频| 日本成人三级电影网站| 亚洲成人久久性| 国产一级毛片七仙女欲春2| 色哟哟哟哟哟哟| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 淫秽高清视频在线观看| a级毛片在线看网站| 两人在一起打扑克的视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产精品国产高清国产av| 免费看a级黄色片| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 99热6这里只有精品| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 精品久久久久久,| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 午夜激情福利司机影院| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 18禁国产床啪视频网站| 老鸭窝网址在线观看| 精品久久久久久成人av| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| av中文乱码字幕在线| 亚洲av电影在线进入| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产伦在线观看视频一区| 少妇人妻一区二区三区视频| 制服丝袜大香蕉在线| 免费看日本二区| 亚洲无线观看免费| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 日本黄大片高清| 久久久国产欧美日韩av| 国产欧美日韩一区二区三| 日本免费a在线| 无人区码免费观看不卡| 免费在线观看日本一区| 不卡av一区二区三区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 脱女人内裤的视频| 国产视频一区二区在线看| 日本 av在线| 母亲3免费完整高清在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产淫片久久久久久久久 | 99久久精品一区二区三区| 精品国产亚洲在线| 床上黄色一级片| 热99re8久久精品国产| 国产亚洲精品一区二区www| av中文乱码字幕在线| 国产黄色小视频在线观看| 国产av一区在线观看免费| 熟女电影av网| 露出奶头的视频| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲中文字幕日韩| 欧美性猛交黑人性爽| 色视频www国产| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 哪里可以看免费的av片| 国产成人欧美在线观看| 一个人看视频在线观看www免费 | 亚洲精品粉嫩美女一区| xxx96com| 在线观看免费视频日本深夜| 九色成人免费人妻av| 99久久精品国产亚洲精品| 又黄又爽又免费观看的视频| 午夜免费观看网址| 精品欧美国产一区二区三| 国产 一区 欧美 日韩| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产一区二区激情短视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 日本 欧美在线| av片东京热男人的天堂| 国产精品永久免费网站| 国产视频一区二区在线看| 午夜福利欧美成人| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 操出白浆在线播放| 中文字幕久久专区| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产精品久久久久久精品电影| 中文亚洲av片在线观看爽| 欧美乱码精品一区二区三区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产免费av片在线观看野外av| 日本五十路高清| 性色av乱码一区二区三区2| 精品久久久久久久久久久久久| 欧美又色又爽又黄视频| 99riav亚洲国产免费| 香蕉久久夜色| 一区福利在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 久久久久久久久中文| 国产精品久久久久久精品电影| 真人一进一出gif抽搐免费| 看片在线看免费视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 最近最新中文字幕大全免费视频| 日韩欧美国产在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 这个男人来自地球电影免费观看| 看片在线看免费视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 女警被强在线播放| 免费av不卡在线播放| 天天添夜夜摸| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 韩国av一区二区三区四区| 日韩欧美国产在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 搞女人的毛片| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产黄a三级三级三级人| 中亚洲国语对白在线视频| 热99re8久久精品国产| 欧美乱码精品一区二区三区| 97碰自拍视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 久久久国产成人精品二区| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 欧美在线黄色| 久久久久九九精品影院| 免费一级毛片在线播放高清视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 精品免费久久久久久久清纯| 国产激情久久老熟女| 欧美日韩综合久久久久久 | 男女那种视频在线观看| 一个人看视频在线观看www免费 | 在线a可以看的网站| 亚洲在线观看片| 超碰成人久久| 精品久久久久久,| 久久久久久久午夜电影| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美中文综合在线视频| 色老头精品视频在线观看| 午夜影院日韩av| 中亚洲国语对白在线视频| 国产av麻豆久久久久久久| 精品电影一区二区在线| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产精品久久久久久久电影 | 男女午夜视频在线观看| 免费搜索国产男女视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 999久久久国产精品视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 人妻久久中文字幕网| 不卡一级毛片| 国产伦人伦偷精品视频| 日韩欧美在线二视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产单亲对白刺激| 欧美三级亚洲精品| 成在线人永久免费视频| 日韩欧美国产在线观看| 日本五十路高清| 久久久久国内视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲国产看品久久| 午夜免费激情av| 亚洲成av人片在线播放无| 搡老岳熟女国产| 亚洲av熟女| 亚洲国产精品久久男人天堂| 成年版毛片免费区| 精华霜和精华液先用哪个| 国产精品av久久久久免费| 黄色丝袜av网址大全| 熟女电影av网| 99热只有精品国产| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美日韩精品网址| 久久久久久久午夜电影| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 免费大片18禁| 午夜久久久久精精品| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产成人精品无人区| 一级毛片精品| 在线永久观看黄色视频| 成年人黄色毛片网站| 免费人成视频x8x8入口观看| a在线观看视频网站| 亚洲av成人一区二区三| www.999成人在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 亚洲国产欧美人成| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲乱码一区二区免费版| 精品一区二区三区视频在线 | 午夜福利高清视频| 俺也久久电影网| 国产精品1区2区在线观看.| 成人午夜高清在线视频| 国产伦在线观看视频一区| a级毛片a级免费在线| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 美女午夜性视频免费| 国产成人av教育| 日本黄大片高清| 国产亚洲av嫩草精品影院| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产免费av片在线观看野外av| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲成人久久性| 最近最新免费中文字幕在线| 无人区码免费观看不卡| 少妇的丰满在线观看| 精品不卡国产一区二区三区| 一a级毛片在线观看| 欧美乱妇无乱码| 99精品在免费线老司机午夜| 黄色女人牲交| 国产欧美日韩一区二区精品| 91九色精品人成在线观看| 国产精品一及| 久久久久性生活片| 婷婷亚洲欧美| 久久久久久久午夜电影| 中文字幕最新亚洲高清| 黄色 视频免费看| 久久久精品大字幕| 91麻豆精品激情在线观看国产| 日本三级黄在线观看| 美女免费视频网站| 国产成人aa在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲最大成人中文| 18禁美女被吸乳视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 97超视频在线观看视频| 狂野欧美激情性xxxx| 国产乱人视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 哪里可以看免费的av片| 日本在线视频免费播放| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产精品久久视频播放| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲精品色激情综合| 午夜激情福利司机影院| 精品福利观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 特级一级黄色大片| 国产成年人精品一区二区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产男靠女视频免费网站| 成年人黄色毛片网站| 亚洲av五月六月丁香网| 久久中文字幕人妻熟女| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产私拍福利视频在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲自拍偷在线| 国产麻豆成人av免费视频| 日本黄大片高清| www.www免费av| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 91在线精品国自产拍蜜月 | www.熟女人妻精品国产| 2021天堂中文幕一二区在线观| 久久九九热精品免费| 国产毛片a区久久久久| 国产成人福利小说| 午夜成年电影在线免费观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 在线观看日韩欧美| 日本黄色视频三级网站网址| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产在线精品亚洲第一网站| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产69精品久久久久777片 | 香蕉国产在线看| 精品不卡国产一区二区三区| 夜夜爽天天搞| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲av第一区精品v没综合| 91九色精品人成在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 岛国视频午夜一区免费看| 国产精品永久免费网站| 一级a爱片免费观看的视频| 色视频www国产| 窝窝影院91人妻| 日韩成人在线观看一区二区三区| bbb黄色大片| 亚洲一区二区三区色噜噜| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美激情久久久久久爽电影| 日日干狠狠操夜夜爽| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 国产探花在线观看一区二区| 最新中文字幕久久久久 | 国产99白浆流出| 亚洲国产色片| av国产免费在线观看| xxx96com| 91av网站免费观看| 动漫黄色视频在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 一区福利在线观看| 丁香六月欧美| 日本免费a在线| 一个人看视频在线观看www免费 | 床上黄色一级片| 国产综合懂色| 久久精品国产清高在天天线| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 伊人久久大香线蕉亚洲五| av女优亚洲男人天堂 | av在线天堂中文字幕| 窝窝影院91人妻| 99精品欧美一区二区三区四区| 观看免费一级毛片| 久久99热这里只有精品18| 欧美极品一区二区三区四区| 国产真人三级小视频在线观看| 一进一出抽搐动态| 一进一出抽搐gif免费好疼| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产淫片久久久久久久久 | 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 亚洲真实伦在线观看| 国产成人影院久久av| 无限看片的www在线观看| 亚洲无线在线观看| 看片在线看免费视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 日日夜夜操网爽| 国产三级黄色录像| 一区二区三区国产精品乱码| 嫩草影院精品99| 国产熟女xx| 一夜夜www| 网址你懂的国产日韩在线| 老鸭窝网址在线观看| 老司机在亚洲福利影院| 日本免费a在线| 一个人看视频在线观看www免费 | 亚洲精品粉嫩美女一区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产精品免费一区二区三区在线| 色综合欧美亚洲国产小说| 五月伊人婷婷丁香| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 美女免费视频网站| 老司机福利观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 天堂影院成人在线观看| 黄片小视频在线播放| 看免费av毛片| 精品久久久久久久毛片微露脸| 无限看片的www在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲 国产 在线| 在线播放国产精品三级| 国产精品av久久久久免费| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产v大片淫在线免费观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久中文看片网| 成人永久免费在线观看视频| 好男人在线观看高清免费视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产精品野战在线观看| 麻豆av在线久日| 亚洲美女黄片视频| 国产精品一区二区免费欧美| 岛国在线免费视频观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产人伦9x9x在线观看| 一个人免费在线观看电影 | 两人在一起打扑克的视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 岛国在线观看网站| 久久这里只有精品19| 亚洲,欧美精品.| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 无人区码免费观看不卡| 黄片小视频在线播放| www日本在线高清视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 一本一本综合久久| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 人人妻人人看人人澡| 又大又爽又粗| 日韩欧美精品v在线| 日日夜夜操网爽| 这个男人来自地球电影免费观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 脱女人内裤的视频| 国模一区二区三区四区视频 | 观看免费一级毛片| av视频在线观看入口| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲黑人精品在线| 人人妻人人澡欧美一区二区| 日韩大尺度精品在线看网址| 日本 欧美在线| 午夜福利18| 国产伦精品一区二区三区四那| 又大又爽又粗| 美女午夜性视频免费| 亚洲午夜理论影院| 欧美色视频一区免费| 丰满的人妻完整版| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 一进一出抽搐动态| 亚洲精品色激情综合| 国产精品一区二区精品视频观看|