IL－1βmRNA在腦梗塞大鼠腦組織表達及針藥結合治療后的免疫干預機制*

顏培宇，王亞賢，于曉紅，代巧妹

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱150040)

腦梗塞是我國中老年人的常見病、多發(fā)病，具有致殘率高、死亡率高等臨床特點。近年來的研究表明，腦梗塞發(fā)生的病理過程中存在炎癥和免疫反應，致炎因子(IL－1β)在炎性反應過程中發(fā)揮重要作用，參與了腦組織的損傷和細胞凋亡過程。筆者運用針藥結合的方法研究腦梗塞大鼠的腦組織IL－1βmRNA表達情況，并與單純電針和單純中藥組進行了比較，現(xiàn)將結果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康Wistar大鼠120只，體重280～350 g，雌雄各半。由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號:scxk(京)2007－0001。

1.2 藥物與試劑

中藥活腦康(丹參12 g，赤芍、五靈脂、雞血藤、羌活、生地黃各9 g，甘草15 g)為黑龍江中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥廠產(chǎn)品;Real Time PCR(HaiGene，SYBR Green熒光定量試劑盒)由上海西唐生物科技有限公司提供);引物合成及相關試劑由海基生物技術公司提供。

1.3 主要儀器

電針儀(G6805－2型，廣東省汕頭市醫(yī)用設備廠);熒光定量 PCR 儀(ABI7500，ABI Corp，USA);Biometra－T PCR 儀(Biometra Corp.Genm)。

1.4 分組與造模方法

將大鼠隨機分為5組，每組6只。即正常對照組(A)、模型組(B)、中藥活腦康組(C)、電針組(D)和中藥活腦康配合電針聯(lián)合治療組(E);C～E組根據(jù)治療時間分為2 d、4 d、6 d和8 d組。B～E組采用Longa的腔內(nèi)線栓法［1］阻滯大鼠右側(cè)大腦中動脈，復制腦梗塞模型。造模后動物在自然蘇醒后，選取出現(xiàn)右側(cè)Honer征(提尾左前肢內(nèi)收屈曲，爬行時向左側(cè)劃圈)的大鼠。

1.5 治療方法

1.5.1 選穴及定位 選取“百會”及“大椎”兩穴，取穴定位參照“十一五”國家規(guī)劃教材《實驗針灸學》［2］和《經(jīng)絡腧穴學》［3］大鼠標準穴位圖定位及擬人對照法定位。

1.5.2 治療方案 ①A組和B組每日給予生理鹽水(6 g/kg)灌胃及綁縛固定;②C組于造模成功24 h后給予活腦康5 ml/支，含藥量1.5 g，灌胃治療，6 g/kg，每日一次;③D組于造模成功24 h后給予電針治療，連續(xù)波，頻率20 Hz，強度 1 ～2 mA，持續(xù) 30 min，每日一次;④E組于造模成功24 h后給予活腦康灌胃后進行電針治療(同D、E組)，每日一次。

1.6 指標測定

各組實驗大鼠分別于治療2 d、4 d、6 d和8 d后，無菌取腦組織，迅速投入液氮中保存。采用RT－PCR法測定各組大鼠腦組織IL－1βmRNA表達情況。

1.6.1 引物 IL－1β 上游引物5'－ATAGCGTGACATTAAGAG－3';下游引物5'－GTGACGATAGTGATGACCT－3';βactin上游引物5'－ATCCCAAACAATACCCA－3';下游引物5'－CAACTATGTCCCGACCA－3'。

1.6.2 大鼠腦組織總RNA提取 ①組織于液氮條件下研磨粉碎，取100 mg裝入1.5 ml EP管中;②向每管中加入1 ml的Trizol Reagent;③用移液槍反復吹吸直至裂解液中無明顯沉淀，室溫靜置5 min;④向上述裂解液中加入200 μl氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩15 s，待充分乳化溶液呈乳白狀(無分相現(xiàn)象)后，室溫靜置5 min;⑤12 000 g 4℃離心15 min;⑥從離心機中小心取出離心管，此時勻漿液分為三層，即無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機相，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中;⑦向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后20℃室溫靜置10 min，12 000 g 4℃離心10 min;⑧小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75%的乙醇1 ml(切勿觸及沉淀)，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁。2～8℃12 000×g離心5 min，棄上清;⑨室溫干燥沉淀5 min，加入100 μl無RNase的水，55～60℃放置10 min完成RNA提取。

1.6.3 反轉(zhuǎn)錄反應(HaiGene，cDNA第一鏈合成試劑盒) 在PCR管中配制混合液，在PCR儀上進行以下反應:65℃，5 min，然后置于冰上急冷。在PCR管中加入反轉(zhuǎn)錄反應液，在PCR儀上按以下條件進行反轉(zhuǎn)錄反應:30℃10 min，42℃30 ～ 60 min，95℃5 min，4℃。定量PCR儀:beta－actin標準曲線制作，樣品5倍稀釋，即為1、5、25、125 copy 數(shù)，擴增結果良好。β － actin溶解曲線制作，結果良好。P標準曲線制作，結果良好。樣品5倍稀釋，即為1、5、25、125 copy數(shù)，擴增結果正常。SP溶解曲線制作，結果良好。

1.7 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用 SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。組間比較采用t檢驗。

2 結果

在腦梗塞造模后2 d，腦組織明顯表達 IL－1βmRNA，4～8 d后，IL－1βmRNA 依然維持較高水平，與正常對照組比較有非常顯著性差異(P＜0.01);治療2天后，與模型組比較，電針組和針藥結合組大鼠IL－1βmRNA表達明顯下降，與模型組比較有非常顯著性差異(P＜0.01);治療4 d后，各治療組大鼠IL－1βmRNA表達均明顯下降，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01)。針藥結合組療效顯著，且維持到治療6 d和8 d后，與單純電針組和單純中藥組比較差異有顯著性(P＜0.05)。電針組和中藥組比較無顯著性差異(P ＞0.05)。見表1。

表1 針藥結合對腦梗塞大鼠腦組織IL－1βmRNA表達的影響(±s)

表1 針藥結合對腦梗塞大鼠腦組織IL－1βmRNA表達的影響(±s)

注:與模型組比較，*P＜0.01;與模型組和中藥組比較，＊＊P＜0.05;與電針組和中藥組比較，▲P ＜0.05;與中藥組比較，＊▲P ＞0.05。

組別n 治療后不同時間點IL－1βmRNA 表達量2 d 4 d 6 d 8 d正常對照組 6 0.91 ±0.18* 0.79 ±0.11*0.87 ±0.16*0.84 ±0.14*模型組 6 2.22 ±0.08 2.11 ±0.07 2.04 ±0.08 2.02 ±0.13電針組 6 1.68 ±0.31＊＊1.89 ±0.16 1.75 ±0.14 1.46 ±0.22＊▲中藥活腦康組 6 2.21 ±0.09 1.61 ±0.25 1.61 ±0.24 1.30 ±0.25電針配合中藥活腦康組6 1.35 ±0.26＊＊1.15 ±0.16 1.14 ±0.12 0.77 ±0.09▲

3 討論

腦梗塞是嚴重危害人類健康的一種常見病、多發(fā)病。梗死后炎癥反應是神經(jīng)細胞死亡的重要原因［4］。IL－1是一種前炎性細胞因子，可在健康大鼠腦皮質(zhì)、海馬部位低水平表達［5］，當腦梗發(fā)生后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小膠質(zhì)細胞分泌IL－1增加，形成局部炎癥，引發(fā)神經(jīng)組織細胞損傷和死亡，加重腦部炎性反應和水腫，引起一系列病理過程［6］。在一系列炎性因子中，IL－1β與炎癥反應密切相關［7］。近期研究發(fā)現(xiàn)，致炎因子(IL－1)等可激活局部血管內(nèi)皮細胞和白細胞，誘導細胞大量的牢固黏附，導致微血管阻塞，從而加重腦細胞損傷。近年來，人們對腦梗死的臨床治療進行了大量的研究［8－10］，針藥結合不失為協(xié)同增效的更好方法。本項研究旨在前人研究的基礎上，探索針藥結合的有效治療機制，尤其是這一傳統(tǒng)的治療方法對機體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機制，以期為臨床治療和基礎研究工作提供更新的數(shù)據(jù)，為針藥結合的推廣使用奠定基礎。

中藥活腦康是本院藥廠自主研發(fā)的復方，在臨床用于治療腦梗塞患者，取得了滿意的療效。主要由丹參、赤芍、五靈脂、雞血藤、羌活、生地黃和甘草等中藥組成，配合電針治療腦梗塞患者療效顯著。為了研究其臨床有效性的免疫調(diào)節(jié)機制，本課題組申報了這一項目，開展了相關研究工作。實驗結果表明，中藥活腦康對腦梗塞大鼠免疫途徑的干預作用，表現(xiàn)在中藥活腦康組與模型組比較，在治療4 d后IL－1βmRNA表達降低;在治療6 d和8 d后IL－1βmRNA表達持續(xù)降低。表明中藥活腦康可抑制腦梗塞大鼠腦組織IL－1βmRNA表達，對腦損傷有一定的保護作用。電針腦梗塞大鼠免疫途徑的干預作用，表現(xiàn)在電針組與模型組比較，治療2 d后IL－1βmRNA表達即降低;在治療4 d、6 d和8 d后IL－1βmRNA表達雖降低，但與針藥結合組比較療效不顯著。表明電針可在早期抑制腦梗塞大鼠腦組織IL－1βmRNA表達，對腦損傷有一定的保護作用，但有時間窗效應。電針配合中藥活腦康組(針藥結合組)對腦梗塞大鼠免疫途徑的干預作用，表現(xiàn)在與模型組比較，在治療4 d后IL－1βmRNA表達明顯降低;在治療6 d和8 d后IL－1βmRNA表達持續(xù)降低，療效優(yōu)于單純電針組和單純中藥活腦康組。表明針藥結合的治療方法可持續(xù)抑制腦梗塞大鼠腦組織IL－1βmRNA表達，對腦損傷有一定的保護作用。

4 結論

腦梗塞大鼠腦組織內(nèi)IL－1βmRNA表達顯著升高，電針在治療早期效果顯著，針藥結合方法可在治療中后期維持這種治療作用，進而控制炎性損傷，促進腦組織修復，隨著治療時間的延長，這種優(yōu)勢更加明顯。

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