一種新的免疫熒光-酶雙重染色技術(shù)

唐和斌，陳倍璠，冷昌龍

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢430074)

免疫組織化學(xué)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、半定量測定的一項(xiàng)技術(shù)［1，2］，根據(jù)標(biāo)記物的不同可分為酶免疫組化、熒光免疫組化、親和免疫組化、免疫金(銀)細(xì)胞染色組化和免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)等［3］.

免疫組化技術(shù)廣泛運(yùn)用于藥理學(xué)和病理學(xué)研究.傳統(tǒng)的免疫組織化學(xué)以免疫單染為主，近年來的雙重免疫染色法是在一張切片上進(jìn)行兩種不同染色的方法，以了解不同細(xì)胞、組織、甚或同一種細(xì)胞內(nèi)抗原之間的相互關(guān)系［4］.目前報(bào)道的雙重免疫染色法有免疫組化和免疫組化、免疫組化和原位雜交、免疫組化和特殊染色等，而免疫酶法和免疫熒光雙結(jié)合的染色檢測方法鮮見.本文以疼痛研究中常用的原代細(xì)胞DRG培養(yǎng)細(xì)胞為對(duì)象，研究其培養(yǎng)系各型細(xì)胞中P物質(zhì)及其受體NK-1R的定位關(guān)系，以建立這種新的免疫熒光-酶雙重染色技術(shù).

1 材料

1.1 試劑和儀器

L-Glutamine、DMEM培養(yǎng)基、馬血清均(美國，GIBCO公司)，D-Glucose(美國，AMRESCO 公司)，兔抗鼠GFAP多克隆抗體，兔抗鼠SP多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，兔抗大鼠MAP-2多克隆抗體、兔抗鼠S100多克隆抗體、鼠抗鼠NK-1R多克隆抗體(英國，ABCAM)，Laminin、膠原酶(美國，SIGMA-ALORICH 公司)，Heal Force HF151/212培養(yǎng)箱(力康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán))，熒光顯微鏡系統(tǒng)(日本，Nikon Eclipse Ti).

1.2 動(dòng)物

Wistar雄性大鼠4只，6～9周齡，150～210 g(湖北省疾病預(yù)防控制中心，SCXK(鄂)2013-0005).動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和處理均遵照國際《The Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals》.

2 方法

2.1 DRG細(xì)胞分離和培養(yǎng)

大鼠飼養(yǎng)2d后脫頸處死，解剖取大鼠脊椎，沿經(jīng)椎間孔剪開，暴露脊髓，鏡下用鑷子摘取DRG細(xì)胞放入冰冷的Hanks液.用膠原酶II/胰蛋白酶消化，吹打成單細(xì)胞懸浮液，接種于10%馬血清 +DMEM培養(yǎng)基中，37℃ 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng)5d.

2.2 免疫熒光和免疫酶法標(biāo)記P物質(zhì)和NK-1R

熒光標(biāo)記:DRG細(xì)胞培養(yǎng)5d后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，0.3%過氧化氫除去內(nèi)源性酶，正常山羊血清室溫封閉30 min，再滴加一抗P物質(zhì)1︰100，NK-1R 4℃過夜，次日滴加二抗FITC標(biāo)記羊抗兔 IgG 1︰1000，避光孵育40 min，封片觀察.

DAB標(biāo)記:用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，0.3%過氧化氫除去內(nèi)源性酶，檸檬酸微波抗原修復(fù)，正常山羊血清室溫封閉30 min，再滴加一抗P物質(zhì)1︰100，NK-1R 1︰100 4℃孵育過夜，次日滴加聚合HRP的羊抗兔IgG 30 min，DAB顯色，鏡下控制發(fā)色時(shí)間，水溶性封片觀察.

2.3 免疫熒光-酶雙重染色標(biāo)記P物質(zhì)和NK-1R

DRG細(xì)胞培養(yǎng)5d后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，0.3%過氧化氫除去內(nèi)源性酶，正常山羊血清室溫封閉30 min，滴加一抗MAP-2 1︰200，4℃孵育過夜，次日先進(jìn)行檸檬酸抗原修復(fù)，再滴加一抗P物質(zhì)抗體1︰100，4℃孵育過夜后，先滴加聚合HRP羊抗兔IgG，孵育30 min，再滴加FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG，DAB顯色，水溶性封片觀察.

MAP-2和NK-1R、GFAP和 NK-1R，S100和 NK-1R雙重染色操作步驟如上.

3 結(jié)果

3.1 DRG神經(jīng)元活細(xì)胞生長狀態(tài)觀察

DRG細(xì)胞培養(yǎng)5d后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)如圖1.由圖1可見，DRG神經(jīng)細(xì)胞大量生長，胞體較大呈圓形或橢圓形，明顯可辨，折光性好，光暈強(qiáng);施萬細(xì)胞分枝明顯延長并增粗，呈兩端帶有突起的梭形;神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)變得稠密;成纖維細(xì)胞則為不規(guī)則的多角形，數(shù)量較多.

圖1 DRG神經(jīng)細(xì)胞Fig.1 The DRG cells of neurons

3.2 免疫熒光法和免疫酶法染色定位DRG細(xì)胞中P物質(zhì)和NK-1R

通過免疫熒光法和免疫酶法定位原代培養(yǎng)的DRG細(xì)胞中P物質(zhì)及NK-1R的表達(dá)，效果不佳.免疫熒光法(圖2a，2c)中雖紅色和綠色陽性標(biāo)記與黑色背景對(duì)比較明顯，但無法辨識(shí)DRG細(xì)胞結(jié)構(gòu)，且P物質(zhì)和NK-1R表達(dá)定位不清晰.免疫酶法(圖2b，2d)中細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)比較清晰，但標(biāo)記物區(qū)分度不強(qiáng)，且背景著色較深，會(huì)對(duì)P物質(zhì)及NK-1R陽性結(jié)果的判定產(chǎn)生一定的干擾.

圖2 免疫熒光法和免疫酶法分別染色的DRG細(xì)胞Fig.2 DRG cells stained by immunofluorescence and immunoenzyme staining

3.3 免疫熒光-酶雙重染色定位P物質(zhì)和NK-1R

結(jié)合免疫酶聯(lián)法和免疫熒光法各自的優(yōu)勢，彌補(bǔ)二者的缺陷，便于觀察免疫染色結(jié)果和定性半定量分析，本文在原代培養(yǎng)的DRG細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了免疫熒光-酶雙重染色.

3.3.1 P物質(zhì)和MAP-2免疫熒光-酶雙重染色

用P物質(zhì)抗體和MAP-2抗體(標(biāo)記DRG神經(jīng)元)進(jìn)行免疫熒光-酶雙重染色，獲得了比較好的效果，結(jié)果見圖3.圖3(a～c)分別為鏡下明場、熒光拍攝和明場熒光疊加的DRG細(xì)胞.由圖3(a)可見，SP呈陽性位于DRG神經(jīng)元中，圖3(b)中綠色熒光為神經(jīng)元的位置，圖3(c)中SP表達(dá)的陽性區(qū)域，神經(jīng)元也呈陽性，并可清楚地辨識(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，P物質(zhì)定位清晰，而免疫酶法和免疫熒光法分別染色無法實(shí)現(xiàn)P物質(zhì)準(zhǔn)確定位.由于P物質(zhì)免疫陽性區(qū)域位于中小型神經(jīng)元中，而不在非神經(jīng)細(xì)胞中，可知P物質(zhì)主要存在于DRG神經(jīng)元中，即P物質(zhì)主要由中小神經(jīng)元合成和釋放，與前期研究結(jié)果一致［5］.

圖3 免疫熒光-酶雙重染色定位的P物質(zhì)Fig.3 Substance P located by immunofluorescenceenzyme double staining

3.2.2 NK-1R 抗體和 MAP-2/GFAP/S100 免疫熒光-酶雙重染色

為驗(yàn)證免疫熒光-酶雙重染色技術(shù)的穩(wěn)定性和可靠性，進(jìn)一步獲得 NK-1R的位置信息，本文對(duì)NK-1R、DRG神經(jīng)元和非神經(jīng)元進(jìn)行免疫熒光染色，其中對(duì)GFAP、S100抗體標(biāo)記的是DRG非神經(jīng)元，MAP-2抗體標(biāo)記的是神經(jīng)元，繼而定位了NK-1R和神經(jīng)元、非神經(jīng)元的位置關(guān)系，證明了NK-1R位于DRG神經(jīng)元內(nèi)，結(jié)果見如圖4.圖4(a～c)中顯示神經(jīng)元和NK-1R染色陽性區(qū)域幾乎重疊，說明NK-1R位于神經(jīng)元中;(d～f)和(g～i)中顯示DRG非神經(jīng)元和NK-1R染色陽性區(qū)域幾乎不存在重疊區(qū)域，說明NK-1R在DRG非神經(jīng)元中不存在.

圖4 免疫熒光-酶雙重染色定位的NK-1RFig.4 NK-1R located by immunofluorescenceenzyme double staining

4 討論

免疫組織化學(xué)染色方法中的免疫酶法和免疫熒光法在實(shí)驗(yàn)藥理和病理研究中運(yùn)用廣泛，經(jīng)歷了從單一標(biāo)記物到雙重標(biāo)記物甚至多重標(biāo)記物的發(fā)展歷程，為科學(xué)研究提供了重要的方法學(xué)支持.但免疫組織化學(xué)也存在諸多問題，尤其是免疫組織化學(xué)的質(zhì)量參差不齊，尚無明確的質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［6］.對(duì)于單一標(biāo)記物免疫染色，何新明等［7，8］認(rèn)為免疫組織化學(xué)技術(shù)受多步驟多環(huán)節(jié)多因素影響，存在誤判和誤診，如假陰性和假陽性.黃華偉［1］認(rèn)為熒光抗體存在光穩(wěn)定性差、光漂白現(xiàn)象等嚴(yán)重問題.謝穎穎［9］研究了不同的固定及滲透方法對(duì)小鼠卵母細(xì)胞免疫熒光染色的影響.對(duì)于雙重免疫染色，路菊［10］認(rèn)為兩個(gè)一抗的搭配和協(xié)調(diào)最重要.對(duì)于免疫酶法目前已實(shí)現(xiàn)多重酶標(biāo)記，但顯色物種類太多后，陽性標(biāo)記之間會(huì)產(chǎn)生串色，無法準(zhǔn)確判定陽性和陰性，顯色物濃度與時(shí)間難以把握，濃度過高或時(shí)間過長均會(huì)造成特異性染色深或假陽性，也可能增加背景染色［6］.

本文結(jié)合研究原代培養(yǎng)的DRG細(xì)胞中P物質(zhì)和NK-1R的定位，對(duì)比分析單獨(dú)使用免疫酶法和免疫熒光法染色的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫熒光法中紅色和綠色陽性標(biāo)記與黑色背景對(duì)比較明顯，但是無法辨識(shí)DRG細(xì)胞結(jié)構(gòu)，且P物質(zhì)和NK-1R表達(dá)定位不清晰.免疫酶法單一標(biāo)記中DRG細(xì)胞結(jié)構(gòu)比較清晰，但背景著色較深，會(huì)對(duì)P物質(zhì)和NK-1R陽性結(jié)果的判定產(chǎn)生一定的干擾.而本研究建立的免疫酶聯(lián)和免疫熒光的結(jié)合的酶聯(lián)-熒光雙重染色法中，既能清晰地辨明DRG細(xì)胞結(jié)構(gòu)，又可對(duì)標(biāo)記物清晰區(qū)分，避免了兩張切片上分別進(jìn)行免疫酶法和免疫熒光法染色后再進(jìn)行細(xì)胞定位和定性的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理時(shí)出現(xiàn)的誤差和爭論，為實(shí)現(xiàn)對(duì)標(biāo)記物的定性和半定量分析提供了重要幫助.

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