重組人腦利鈉肽對(duì)動(dòng)脈硬化大鼠血管內(nèi)皮功能的影響

周 琳，張 靜，袁天陽(yáng)，李揚(yáng)雪，徐艷玲，戴 琎

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院 心血管內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130041）

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）其主要病變特點(diǎn)是動(dòng)脈病變從血管內(nèi)膜開(kāi)始，局部有脂質(zhì)和復(fù)合糖類聚集，出血和血栓形成，纖維組織增生和鈣鹽沉積，并有中層的逐漸退化及鈣化。但其發(fā)病機(jī)制尚無(wú)定論，目前較為接受的學(xué)說(shuō)是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的反應(yīng)假說(shuō)。當(dāng)內(nèi)皮功能障礙時(shí)可導(dǎo)致血管收縮、血栓形成、內(nèi)膜增生等。因此保護(hù)血管內(nèi)皮功能成為治療動(dòng)脈粥樣硬化的新趨勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 材料

40只健康Wistar大鼠購(gòu)自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。重組人腦利鈉肽 （新活素），由成都諾迪康生物制藥有限公司提供，單硝酸異山梨酯（華仁欣舒），由青島華仁藥業(yè)提供，阿魏酸鈉（海斯），由晉城海斯制藥有限公司提供。高脂飼料（普通面料88.8%，由吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院提供；豬油10%，由吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院提供；膽固醇1%，由沈陽(yáng)試劑五廠提供；豬膽鹽0.2%，由中國(guó)惠氏生化試劑有限公司提供）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立和動(dòng)物分組 40只健康 Wistar大鼠，均為雄性，體重為（220±10）g，實(shí)驗(yàn)室保持室內(nèi)安靜，飼養(yǎng)溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度40%－50%，通風(fēng)良好，自然光照，光－暗周期12 h，自由進(jìn)普通飼料、水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)1周后按體重質(zhì)量隨機(jī)分成5組，對(duì)照組、模型組、硝酸酯處理組、阿魏酸鈉處理組及新活素處理組各8只。除對(duì)照組繼續(xù)喂養(yǎng)普通飼料外，余4組給予維生素D3灌胃（按5×105U／kg的總量分3天灌胃），其后飼以高脂飲食。實(shí)驗(yàn)周期為12周。

1.2.2 給藥途徑 硝酸酯處理組：給予皮下注射單硝酸異山梨酯3mg／kg每日一次，阿魏酸鈉處理組：給藥劑量（mg／kg）＝W×人注射劑量（mg／kg）。（人靜點(diǎn)阿魏酸鈉劑量按400mg／60kg／d，W為折算系數(shù)取6.25），每日皮下注射一次。新活素處理組：給予rhBNP 0.1mg／kg每日一次皮下注射。對(duì)照組，模型組均給予等劑量的生理鹽水。

1.2.3 生化指標(biāo)測(cè)定 采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL－C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL－C）水平。

1.2.4 TXB2、6－Keto－PGF1a的測(cè)定 5組分別在處理前及處理后抽血4ml，3 500r／min離心15 min，分離出血清，－80℃冰箱保存。所有標(biāo)本與收集后統(tǒng)一檢測(cè)。分別采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)各組用藥前后血清中 TXB2、6－Keto－PGF1a濃度。

1.2.5 主動(dòng)脈切片的制備 用乙醚麻醉動(dòng)物，心臟取血后，立即取完整主動(dòng)脈（從主動(dòng)脈根部至髂總動(dòng)脈分叉處），經(jīng)10%甲醛溶液固定后，常規(guī)石蠟包埋，切片二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇至水洗，蘇木紫染色5min，鹽酸乙醇化30s，自來(lái)水浸泡15min后，置伊紅液2min，常規(guī)脫水、透明、封片。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組參數(shù)用±s表示，同組藥物處理前后比較采用配對(duì)樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，P＞0.05差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重的變化（表1）：12周后，高脂飼料組與對(duì)照組比較體重有明顯差異P＜0.05。

表1 各組間大鼠體重的比較（±s）（單位：g）

表1 各組間大鼠體重的比較（±s）（單位：g）

注：＊各組與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異，P＞0.05；#各組與對(duì)照組比較有顯著性差異，P＜0.05

n第1周 第4周 第8周 第12周18模型組 8 244.50±6.0＊ 384.1±8.37# 423.0±6.87# 455.0±13.8#硝酸酯組 8 247.50±9.0＊ 385.0±4.08# 427.5±6.29# 460.0±12.9#阿魏酸鈉組 8 247.23±10.53＊ 387.5±6.92# 431.6±7.45# 461.0±12.1#新活素組 8 247.00±13.52＊ 388.3±7.45# 430.0±6.45# 458.0±15.7對(duì)照組 8 243.10±8.8 363.3±7.08 393.0±5.77 413.0±7.#

2.2 各組血脂及相關(guān)成分的濃度的變化（表2）：高脂飲食組血脂水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），各處理組之間血脂水平未見(jiàn)明顯差異（P＞0.05）。

表2 各組間大鼠血脂及相關(guān)指標(biāo)的結(jié)果（±s）（mmol／L）

表2 各組間大鼠血脂及相關(guān)指標(biāo)的結(jié)果（±s）（mmol／L）

注：#各組與對(duì)照組比較有顯著差異，P＜0.05；＊處理組之間比較未見(jiàn)明顯改變，P＞0.05

8 3.6±0.42 1.68±0.18 2.02±0.05 2.84±0.23模型組 8 13.0±0.47# 5.89±0.40# 1.39±0.26# 3.92±0.18#硝酸酯組 8 13.7±0.92#＊ 5.92±0.29#＊ 1.39±0.21#＊ 3.93±0.10#＊阿魏酸鈉組 8 14.3±0.72#＊ 5.93±0.20#＊ 1.34±0.15#＊ 3.92±0.16#＊新活素組 8 14.4±0.46#＊ 5.94±0.16#＊ 1.41±0.16#＊ 3.93±0.14#＊TC TG HDL－C LDL－C對(duì)照組n

2.3 大鼠主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化

2.3.1 肉眼觀察情況

對(duì)照組血管彈性較好，內(nèi)膜光滑，富有光澤。高脂組：動(dòng)脈彈性減低，管壁增厚，內(nèi)膜光澤度較對(duì)照組差。各處理組之間肉眼觀察較模型組無(wú)明顯改變。

2.3.2 光鏡觀察結(jié)果 光鏡觀察提示（×100倍）：對(duì)照組中大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜血管內(nèi)皮排列有序，未見(jiàn)異常改變。模型組中大鼠主動(dòng)脈血管壁局部形成粥樣斑塊向管腔內(nèi)突出，引起管腔狹窄，斑塊由泡沫細(xì)胞和膽固醇結(jié)晶構(gòu)成，彈力纖維斷裂，動(dòng)脈外膜變薄，呈現(xiàn)較典型的動(dòng)脈粥樣硬化改變。光鏡觀察提示（×200倍）：對(duì)照組主動(dòng)脈EC排列有序，無(wú)明顯改變。模型組中可見(jiàn)血管內(nèi)膜不光滑，局部可見(jiàn)泡沫細(xì)胞和膽固醇結(jié)晶。

進(jìn)一步放大（×400倍）觀察提示：對(duì)照組動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，EC排列整齊有序、無(wú)缺失，內(nèi)膜下間隙較?。荒Ｐ徒M血管壁增厚，內(nèi)膜不光滑，排列紊亂，EC成連續(xù)性缺失，底層膠原纖維暴露，大量MC粘附于內(nèi)皮表面或潛入內(nèi)皮下，內(nèi)皮下間隙增寬；處理組內(nèi)膜較光滑，局部有少量MC粘附，可見(jiàn)EC缺失，但好于模型組，處理組之間未見(jiàn)明顯差別。（見(jiàn)圖1－12）

圖1 模型組主動(dòng)脈組織HE染色×100

圖2 正常對(duì)照組主動(dòng)脈組織HE染色×100

圖3 模型組主動(dòng)脈組織HE×200

圖4 正常對(duì)照組主動(dòng)脈組織HE×200

圖5 硝酸酯處理組主動(dòng)脈組織HE×200

圖6 阿魏酸鈉處理組主動(dòng)脈組織HE×200

圖7 新活素處理組主動(dòng)脈組織HE×200

圖8 模型組主動(dòng)脈組織HE×400

圖9 正常對(duì)照組主動(dòng)脈組織HE×400

圖10 硝酸酯處理組主動(dòng)脈組織HE×400

圖11 阿魏酸鈉處理組主動(dòng)脈組織HE×400

圖12 新活素處理組主動(dòng)脈組織HE×400

2.4 處理組前后TXB2和6－Keto－PGF1a變化的比較（±s）

處理組在處理前的TXB2和6－Keto－PGF1a之間組間比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但是其與對(duì)照組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各處理組治療前后TXB2和6－Keto－PGF1a比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），處理后好于處理前。見(jiàn)表3。

表3 處理前后大鼠TXB2和6－Keto－PGF1a變化的比較（±s）

表3 處理前后大鼠TXB2和6－Keto－PGF1a變化的比較（±s）

注：＊各組處理前比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＞0.05，# 每組與處理前比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）

TXB 2 6－Keto－PGF1 n α 8 100.5±3.77 100.4±3.36 61.6±3.35 61.8±2.32模型組 8 150.5±3.98＊ 152.6±3.94 48.7±1.93＊ 49.4±1.40#硝酸酯組 8 150.5±2.62＊ 136.2±2.0# 47.7±2.24＊ 63.0±2.23#阿魏酸鈉組 8 150.4±4.74＊ 123.7±1.5# 50.1±2.41＊ 72.89±2.09#新活素組 8 151.5±5.31＊ 114.0±1.7# 50.41±2.28＊ 83.61±1.30處理前 處理后對(duì)照組處理前 處理后#

2.5 不同藥物對(duì)TXB2、6－Keto－PGF1a處理后結(jié)果的比較（±s）

硝酸酯類、阿魏酸鈉、新活素處理后TXB2、6－Keto－PGF1a在各組略有不同，新活素組不劣于硝酸酯組及阿魏酸鈉組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

從本研究結(jié)果得到：rhBNP提高動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血清中PGI2的含量，降低TXA2的含量，并且在形態(tài)上改善動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的血管內(nèi)皮功能。

正常情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞是一種具有選擇性的通透膜，具有促進(jìn)分子之間的交換的功能，是血液與組織的一道天然屏障。它同時(shí)具有感受器及效應(yīng)器功能，又是人體最大，功能活躍的內(nèi)分泌，旁分泌及自分泌代謝器官，產(chǎn)生和分泌多種生物活性物質(zhì)［1］，對(duì)血管的張力、生長(zhǎng)、脂質(zhì)代謝等方面起著調(diào)控作用。而PGI2／TXA2的平衡是維持內(nèi)皮細(xì)胞完整的重要環(huán)節(jié)也是維持血小板正常形態(tài)和血液凝固的重要機(jī)制。在長(zhǎng)期血脂紊亂情況下，增高的脂蛋白尤其是極低密度脂蛋白和膽固醇對(duì)動(dòng)脈內(nèi)膜產(chǎn)生功能性損傷，使單核細(xì)胞聚集、各種炎性因子分泌增多，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)締組織增生、平滑肌細(xì)胞增殖。循環(huán)血液中的血小板就可粘附在損傷部位，致使TXA2合成增加，而PGI2合成減少，從而導(dǎo)致PGI2／TXA2平衡失調(diào)。正因?yàn)槿绱?，如何?yīng)用藥物干預(yù)PGI2／TXA2的平衡將成為治療動(dòng)脈粥樣硬化的新靶點(diǎn)。本研究分別應(yīng)用硝酸酯、阿魏酸鈉及rhBNP觀察TXB2和6－Keto－PGF1a的變化旨在揭示不同藥物對(duì)PGI2／TXA2系統(tǒng)的影響，探討新活素改善內(nèi)皮功能的機(jī)制。

rhBNP是利用基因工程技術(shù)合成的與BNP生物作用完全相同的重組產(chǎn)物，其在心力衰竭中的應(yīng)用已得到廣泛認(rèn)可。目前已有文獻(xiàn)表明了rhBNP在冠心病中的應(yīng)用。已有研究表明張桂娟研究表明PGI2的含量與冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)成反比，動(dòng)脈硬化越嚴(yán)重，PGI2合成越少，提示冠心病患者存在血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌血管活性物質(zhì)的平衡失調(diào)［2］。魏慶民等關(guān)于rhBNP對(duì)豬急性心肌梗死患者PCI術(shù)后心室重塑和心室收縮同步性影響的研究證明rhBNP對(duì)急性心肌梗死的治療有效，無(wú)副作用［3］。美國(guó)加州大學(xué)舊金山醫(yī)學(xué)中心通過(guò)冠脈造影及冠脈內(nèi)超聲（IVUS），觀察應(yīng)用rhBNP治療ACS患者對(duì)冠狀動(dòng)脈血管的影響，發(fā)現(xiàn)靜脈給藥30min，冠脈動(dòng)脈血管明顯擴(kuò)張，心肌耗氧量下降8%，提示rhBNP對(duì)ACS患者有治療益處［4］。王智慧等應(yīng)用rhBNP治療44例急性冠脈綜合征患者臨床觀察中，在常規(guī)藥物治療的基礎(chǔ)上加用rhBNP后發(fā)現(xiàn)治療前后血清中NO及ET－1的含量差值較對(duì)照組患者血清中NO及ET－1的含量差值變化明顯［5］。

給予硝酸酯、阿魏酸鈉、rhBNP等藥物治療后，TXB2及6－Keto－PGF1a與處理前比較有差異（P＜0.05），二者趨于正常平衡。各處理組之間的比較無(wú)明顯差異，但新活素處理組不劣與硝酸酯、阿魏酸鈉組。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組人腦利鈉肽（新活素）對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變血液中PGI2、TXA2有影響，rhBNP改善血管內(nèi)皮功能可能是通過(guò)維持PGI2－TXA2的穩(wěn)定來(lái)發(fā)揮作用的。本實(shí)驗(yàn)提示了rhBNP不僅作為治療急性失代償性心衰的藥物，在治療動(dòng)脈粥樣硬化中也發(fā)揮重要作用。

［1］Anderson TJ.Asseement and treatment of endothelium dysfuction in humans［J］.Am coll cardiol，1999，34：631.

［2］張桂娟，趙 頌，張香梅 .冠心病患者血漿中內(nèi)皮素和前列腺素變化的臨床意義及其與冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)的關(guān)系［J］.中國(guó)綜合臨床，2002，18（5）：419.

［3］魏慶民，等.靜脈應(yīng)用重組人腦利鈉肽對(duì)急性心肌梗死經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療后患者心室重塑和左心功能的影響［J］.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)雜志，2007，10（8）：615.

［4］Andrew D.Effects of intravenous nesiritide on human coronary Vasomotor regulation and myocardial oxygen uptake［J］.Circulation，2003，107：2697.

［5］王智慧.重組人腦利鈉肽對(duì)急性冠脈綜合征患者內(nèi)皮功能相關(guān)因子的影響［D］.長(zhǎng)春：吉林大學(xué)第二醫(yī)院，2010.