趨化因子受體CCR7在乳腺癌細胞株上的表達及意義

郭滿盈，張 茵，羅雪平，陳 揚，王 棟

（解放軍第98醫(yī)院1.檢驗科；2.院部，浙江 湖州313000；3.第二軍醫(yī)大學解剖學教研室，上海200433）

多種趨化因子及其受體與惡性腫瘤的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移有關(guān)，乳腺癌等多種腫瘤細胞表面有CCR5、CXCR4等趨化因子受體的表達，而且所表達趨化因子受體的不同可能與特定靶器官的定向轉(zhuǎn)移有關(guān)［1－2］。趨化因子受體CCR7是否參與乳腺癌轉(zhuǎn)移，作用如何，尚無定論。本組對乳腺癌細胞株MDA－MB－361上CCR7的表達進行了檢測，為乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移機制的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 乳腺癌細胞株 MDA－MB－361由第二軍醫(yī)大學解剖學教研室常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 Trizol RNA提取試劑盒，購自Life Technologies公司；CCR7mRNA引物由上海生物工程公司合成；M－MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、DTT、DEPC等購自 Gibco公司；Oligo－dT15購自Promega公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs購自TakaRa公司；鼠抗人CCR7mAb購自RD公司；免疫組化用第二抗體試劑盒購自美國LABvision公司。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌細胞株CCR7mRNA的檢測 取1×106乳腺癌細胞，按照Trizol RNA提取試劑盒說明提取細胞總RNA，取6μg總RNA與0.5μg oligodT15混合，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以其作為模板，PCR擴增CCR7中一大小為530bp的片段，所用的上游引物為5′－TCCTTCTCATCAGCAAGCTGT－3′，下游引物 為 5′－GAGGCAGCCCAGGTCCTTGAAG－3′。具體反應(yīng)步驟為：37℃ 1h，72℃ 5 min，完成逆轉(zhuǎn)錄；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)完成PCR后，再72℃充分延伸10min。以人GAPDH作為內(nèi)對照，其上游引物為5＇－GGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCG－3＇，下游引物為5＇－CCTCCGACGCCTGCTTCACCAC－3＇，大小為788bp。擴增產(chǎn)物進行1.5g／L瓊脂糖凝膠電泳，以GAPDH作為內(nèi)對照，凝膠成像掃描儀分析，比較乳腺癌細胞中CCR7的相對表達量。

1.2.2 乳腺癌細胞株CCR7蛋白的檢測 干凈的蓋玻片放入培養(yǎng)皿中，使細胞貼壁在蓋玻上，培養(yǎng)24h，取出蓋玻片，經(jīng)PBS洗后，用4%多聚甲醛固定30min，85%、95%和100%乙醇脫水，用中性樹脂將蓋玻片無細胞面貼在載玻片上，經(jīng)風干后可做免疫組化。主要步驟如下：①0.3%H2O2室溫反應(yīng)20min，或3%H2O2室溫反應(yīng)5min，用以清除內(nèi)源性過氧化物酶反應(yīng)，PBS浸泡5min。② 加工作濃度的一抗（約10μg／ml），37℃，1h，PBS沖洗3×3min。③ 加生物素化羊抗鼠IgG，37℃，30min，PBS沖洗3×3min。④ 加Streptavidin－HRP，37℃，30min，PBS沖洗3×3min。⑤ DAB染色，5－10min，水洗。⑥ 蘇木素襯染，樹脂封片，鏡檢。陽性結(jié)果判斷為細胞膜、漿上呈棕褐色，背景為淡藍色。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌細胞株CCR7mRNA的表達 通過RT－PCR法能從乳腺癌細胞株 MDA－MB－361中擴增出GAPDH基因片段和CCR7中選定的基因片段，以GAPDH作為內(nèi)對照，凝膠成像掃描儀分析，比較乳腺癌細胞中CCR7的相對表達量為1.56，見圖1。

圖1 乳腺癌細胞株CCR7mRNA的表達（條帶1）

2.2 乳腺癌細胞株CCR7的蛋白表達 免疫組化法檢測到乳腺癌細胞株 MDA－MB－361細胞膜、細胞漿上有CCR7的蛋白表達，見圖2。

圖2 乳腺癌細胞株細胞膜、細胞漿上CCR7的蛋白表達（200×）

3 討論

CCR7早先稱為孤兒受體EBI1，最初是由于B細胞感染EB病毒而被發(fā)現(xiàn)，在幼稚T細胞（naive T）、B細胞及樹突狀細胞（dendritic cells，DC）表面表達，隨DC的成熟，CCR7的表達也上調(diào)。CCR7及其配體CCL19、CCL21在淋巴器官的生長發(fā)育以及淋巴細胞、樹突狀細胞向淋巴結(jié)的歸巢中發(fā)揮重要的作用［3］。Muller等［4］首次提出腫瘤細胞利用趨化因子受體與其配體的特異性結(jié)合而實現(xiàn)靶向性轉(zhuǎn)移的理論，乳腺癌細胞可能利用與淋巴細胞、樹突狀細胞向淋巴結(jié)歸巢一樣的機制，即通過細胞表面的CCR7和淋巴結(jié)表達的CCL19、CCL21特異性結(jié)合來實現(xiàn)向淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。

本檢測結(jié)果表明，乳腺癌細胞系MDA－MB－361高表達CCR7，其高表達可為下一步的實驗研究打下基礎(chǔ)。本組也曾發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中有CCR7的表達，而且在原位癌組織與發(fā)生轉(zhuǎn)移癌組織中其表達率無顯著性差異，說明CCR7在乳腺癌發(fā)生的早、中期就可能發(fā)揮作用［2］。

CCR7在癌細胞轉(zhuǎn)移動態(tài)過程中具體作用尚待進一步探討，對高表達CCR7的乳腺癌細胞系的進一步實驗研究可能會有助于更多機制的發(fā)現(xiàn)。

［1］吳高松，馬小鵬，劉巖巖，等.趨化因子SDF－1a生物半衰期預(yù)測乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移［J］.中華普通外科雜志，2010，25（11）：907.

［2］郭滿盈，羅媛燁，陳 揚，等.趨化因子受體CCR6及CCR7在乳腺癌組織上的表達與意義［J］.國際檢驗醫(yī)學雜志，2009，30（1）：28.

［3］楊銀龍，歐周羅，邵志敏.CCL19／21－CCR7生物學軸與腫瘤轉(zhuǎn)移［J］.國際腫瘤學雜志，2006，33（8）：564.

［4］Muller A，Homey B，Soto H，et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis［J］.Nature，2001，410（6824）：50.