比較皮試法與ELISA法在林芝牛結(jié)核病檢測中的對比試驗

牛家強，索朗曲扎，徐業(yè)芬，拉巴頓珠，李 鵬，2

（1.西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動科學(xué)院，西藏 林芝860000；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀100193）

牛結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌復(fù)合群（主要是牛型結(jié)核分枝桿菌）所引起的一種人畜共患慢性傳染病，呈世界性分布，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為B類動物疫病，在我國被列為二類動物疫病。目前，發(fā)達(dá)國家基本上根除或控制了牛結(jié)核病，而發(fā)展中國家卻呈廣泛傳播與蔓延，我國成為世界上結(jié)核病負(fù)擔(dān)最重的22個國家之一，全球排名第二［1］。近年來，我國結(jié)核病的陽性檢出率逐年上升［2］，作為全國五大牧區(qū)之一的西藏，由于當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民具有飲生水、飲生牛奶和生食牛肉的習(xí)慣，再加上牛羊群散牧，糞便及其他體液污染水源及周圍環(huán)境，流動人口的增加及人群密切接觸，使感染結(jié)核病的幾率大大增加［3］，很可能是造成該地區(qū)結(jié)核病流行的主要原因之一。

當(dāng)前國內(nèi)外用于牛結(jié)核病診斷的方法主要有；根據(jù)臨床癥狀和病理變化診斷、細(xì)菌分離培養(yǎng)法、結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)（PPD）、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗、γ－干擾素試驗和血清學(xué)方法等，無論哪種檢測方法都有其優(yōu)缺點。但比較皮試法（比較結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)）的陽性符合率最高，結(jié)果較準(zhǔn)確，成為多個國家法定的檢測方法［4］。ELISA檢測法（酶聯(lián)免疫吸附試驗）具有方便、快速，高通量、可自動化、特異性強等特點，越來越多地用于牛結(jié)核病的檢測中。為了弄清林芝某地牛結(jié)核病的感染狀況，進(jìn)行了以下試驗，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 游標(biāo)卡尺，1mL一次性注射器，剪毛剪，牛結(jié)核菌素ELISA抗原檢測試劑盒、禽型和牛型提純結(jié)核菌素液體（國家標(biāo)準(zhǔn)品，5mL／支，100 000IU／mL），均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

試驗牛為林芝某村莊散養(yǎng)牛，共計96頭（其中牦牛40頭，犏牛20頭，黃牛36頭）。

1.2 方法 試驗時將96頭試驗牛進(jìn)行隨機編號，按照先采血后進(jìn)行PPD試驗的順序進(jìn)行，并做好詳細(xì)記錄。

1.2.1 ELISA試驗

1.2.1.1 待檢血清 試驗牛頸靜脈無菌采血各5 mL，置離心管45°傾斜4℃過夜，然后用移液器小心吸取血清，備用。

1.2.1.2 牛結(jié)核菌素ELISA檢測試劑盒 按以下操作步驟進(jìn)行：（1）配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水做30倍稀釋后備用；（2）編號：將樣品與對應(yīng)微孔按序編號，每板設(shè)陰、陽性對照各2孔、空白對照1孔；（3）加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰、陽性對照50μL。在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μL，再加待測樣品10μL，然后輕輕晃動混勻；（4）溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30min；（5）洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30′后棄去，如此重復(fù)5次，拍干；（6）加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外；（7）溫育：操作同4；（8）洗滌：操作同5；（9）顯色：每孔先加入顯色劑 A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min；（10）終止：每孔加終止液50μL，顏色由藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色，即為反應(yīng)終止；（11）測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。

1.2.1.3 計算 以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

1.2.1.4 判定標(biāo)準(zhǔn) 試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00；陰性對照孔平均值≤0.15；臨界值（CUT OFF）計算：臨界值＝陰性對照孔平均值＋0.20；陰性判定：樣品OD值＜臨界值（CUT OFF）者為牛結(jié)核病抗體（TB－Ab）陰性；陽性判定：樣品OD值≥臨界值（CUT OFF）者為牛結(jié)核病抗體（TB－Ab）陽性。

1.2.2 比較皮試試驗 （1）注射部位與術(shù)前處理：保定好試驗牛，在其頸部同側(cè)中部上1／3處和下1／3處或兩側(cè)中部上1／3處分別剪毛，直徑約為10cm。若注射位點位于同側(cè)時，上1／3處為牛型結(jié)核菌素注射位點，下1／3處為禽型結(jié)核菌素注射位點，且間隔約15cm。若注射位點位于兩側(cè)時，左右側(cè)分別為牛型、禽型結(jié)核菌素注射位點，由專人用游標(biāo)卡尺分別測量兩個注射部位的皮皺厚度；（2）注射劑量與方法：先用75%酒精棉球進(jìn)行術(shù)部消毒，再用1mL注射器分別吸取牛型、禽型結(jié)核菌素各0.1mL，然后左手捏起皮膚，右手持針管，將針頭與皮膚成30°～45°角刺入表皮與真皮之間，緩慢注射，以局部形成丘疹狀隆起為準(zhǔn)，經(jīng)72h后再次測量皮皺厚度；（3）結(jié)果觀察與判定：注射后72h，仔細(xì)觀察牛頸側(cè)注射部位局部有無熱痛、腫脹等炎性反應(yīng)，并由專人用游標(biāo)卡尺測量皮皺厚度；用牛結(jié)核菌素導(dǎo)致的皮厚增加扣除禽結(jié)核菌素導(dǎo)致的皮厚增加作為結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)。若注射部位局部有明顯的炎癥反應(yīng)，皮皺厚度增加4mm及以上者為陽性；若注射部位局部炎癥反應(yīng)不明顯，皮皺厚度增加2～4mm者為可疑；若注射部位局部無炎癥反應(yīng)，皮皺厚度增加2 mm以下者為陰性。可疑牛經(jīng)42d后重復(fù)上述試驗，結(jié)果仍為可疑及以上者，直接判為陽性，否則為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 比較皮試法與ELISA法的檢測結(jié)果 對96頭牛同時應(yīng)用比較皮試法和ELISA法進(jìn)行了檢測，結(jié)果見表1。從表1可以看出，比較皮試法檢出陽性牛14頭，陰性牛82頭，陽性檢出率為14.58%（14／96）；而ELISA法檢出陽性牛10頭，陰性牛86頭，陽性檢出率為10.42%（10／96）；說明不管那種檢測方法的檢測結(jié)果，證明該牛群均為牛結(jié)核污染牛群，且比較皮試法的陽性檢出率明顯高于ELISA法，它們之間的陽性符合數(shù)為10頭，陽性符合率為83.33%（10／12），表明兩種方法間具有較好的陽性符合率。

2.2 不同牛品種間檢測結(jié)果的比對 同時對96頭牛應(yīng)用比較皮試法和ELISA法進(jìn)行了檢測，不同牛品種間的檢測結(jié)果見表2。從表2可以看出；若以比較皮試法作為金標(biāo)準(zhǔn)時，牦牛的陽性率為15%（6／40），犏牛的陽性率為10%（2／20），黃牛的陽性率為16.67%（6／36）。反之，若以ELISA法作為金標(biāo)準(zhǔn)時，則牦牛的陽性率為10%（4／40），犏牛的陽性率為0%（0／20），黃牛的陽性率為16.67%（6／36）。從而證明該牛群中，結(jié)核桿菌黃牛最易感，牦牛次之，犏牛最不敏感。

表1 比較皮試法和ELISA法檢測 （單位：頭）

表2 不同牛品種間運用比較皮試法和ELISA法檢測 （單位：頭）

2.3 比較皮試法與ELISA法兩種檢測方法的比對同時對96頭牛應(yīng)用比較皮試法和ELISA法進(jìn)行了檢測，但在兩種檢測方法中，如果以比較皮試法作為金標(biāo)準(zhǔn)，比較皮試法的14頭陽性牛中，ELISA法的陽性符合數(shù)為10頭，其敏感性為71.43%（10／14）；82頭比較皮試法陰性牛中，ELISA法試驗檢出的陰性牛為82頭，特異性為100%（82／82），結(jié)果見表1。如果以ELISA法作為金標(biāo)準(zhǔn)，ELISA法的86頭陰性牛中，比較皮試法檢出的陰性牛為82頭，特異性為95.35%（82／86），表明兩種方法具有同等良好特異性，但敏感性比較皮試法明顯優(yōu)于ELISA法。

3 討論與小結(jié)

3.1 多數(shù)情況下，國內(nèi)依據(jù)結(jié)核分支桿菌對結(jié)核菌素能產(chǎn)生一種遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)，只進(jìn)行單純的牛型PPD試驗，結(jié)果檢出的陽性中包含了非結(jié)核分枝桿菌感染，因此，該方法并不理想。本試驗所選用牛結(jié)核菌素與禽結(jié)核菌素同時做皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢測，用牛型結(jié)核菌素導(dǎo)致的皮厚增加扣除禽型結(jié)核菌素導(dǎo)致的皮厚增加作為結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，其中禽型結(jié)核菌素檢測結(jié)果代表非結(jié)核分枝桿菌感染結(jié)果，從而排除了非結(jié)核分枝桿菌感染的假陽性結(jié)果。因此，比較皮試法的檢測結(jié)果比較準(zhǔn)確，還具有較高的敏感性和特異性［5］。本試驗在牛結(jié)核ELISA陰性牛中，仍檢出了部分牛結(jié)核變態(tài)反應(yīng)陽性牛，這說明ELISA試驗并不能檢出所有的結(jié)核病牛。我們認(rèn)為，這是由于結(jié)核分枝桿菌在動物體內(nèi)的細(xì)胞免疫和體液免疫分離所造成的，在細(xì)胞免疫很強的情況下，體液免疫并不一定很強。

3.2 本試驗中，比較皮試法是檢測細(xì)胞免疫的，而ELISA是檢測體液免疫的。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌感染動物時，動物機體對結(jié)核分枝桿菌的免疫首先是細(xì)胞免疫，其次才是體液免疫，這二者是分離的。因為結(jié)核分枝桿菌屬于胞內(nèi)寄生菌，細(xì)胞免疫是主要的，只有機體抵抗力弱，病原體向周圍擴散，進(jìn)入血液和體液中時，才能刺激機體產(chǎn)生大量的抗體［6］。新近感染結(jié)核分枝桿菌的牛，其細(xì)胞免疫已經(jīng)開始，但細(xì)菌抗原尚不能刺激機體產(chǎn)生強烈的體液免疫；感染過結(jié)核分枝桿菌，但機體抵抗力很強時，限制了結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)的增殖、擴散，則體液免疫產(chǎn)生的抗體量很少。此外，非典型分枝桿菌感染及患有寄生蟲病等非特異性因素的干擾，均可引起牛的變態(tài)反應(yīng)陽性，而體液免疫的水平卻很低［7－8］。本試驗中，比較皮試法的陽性檢出率要高于ELISA法，我們認(rèn)為，這也是它們分別檢測細(xì)胞免疫和體液免疫的一個表現(xiàn)［9］。

3.3 本試驗中，比較皮試法的敏感性明顯高于ELISA法，而且它們具有較高的符合率。我們認(rèn)為，該試驗牛群屬于嚴(yán)重結(jié)核分枝桿菌感染牛群，由于結(jié)核分枝桿菌持續(xù)感染，導(dǎo)致機體免疫已由最初的單純細(xì)胞免疫很強的階段發(fā)展到了細(xì)胞免疫與體液免疫并重的階段，導(dǎo)致了本試驗的抗體檢測陽性率高；另外比較皮試法的敏感性高，我們也不排除此試驗中是否存在著一定的非特異性反應(yīng)。所以應(yīng)先以比較皮試法檢疫牛群，對陽性牛再用ELISA法檢測，才能達(dá)到準(zhǔn)確凈化與控制牛結(jié)核病的目的。依據(jù)主要有：（1）ELISA法檢測陽性的，不管其變態(tài)反應(yīng)陽性還是陰性，都認(rèn)為是活動型結(jié)核，應(yīng)堅決予以捕殺；（2）比較皮試法陽性而ELISA法陰性的，一般是結(jié)核病初期、封閉型結(jié)核或非特異性反應(yīng)。應(yīng)立即進(jìn)行隔離飼養(yǎng)或堅決淘汰，并加強ELISA檢測。因為結(jié)核病初期、封閉型結(jié)核有可能因病情加重或轉(zhuǎn)化為開放型結(jié)核而使抗體檢測轉(zhuǎn)化為陽性。只要ELISA檢測陽性牛，應(yīng)堅決予以捕殺，兩種方法有機結(jié)合，才能達(dá)到凈化與控制牛結(jié)核病的目的。

3.4 本試驗是在西藏高原正值枯草的季節(jié)進(jìn)行，試驗牛膘情較差。由于牦牛具有很強的攀爬能力，采食量相對黃牛較高，基本能夠滿足機體之所需，因此，機體狀況較好；而黃牛雖然進(jìn)行了一定的人工補飼，仍很難維持機體基本需求；犏牛卻遺傳了前兩者的優(yōu)點，膘情最好。此時一旦接觸結(jié)核分枝桿菌，則會立即引起不同程度的免疫反應(yīng)，也可能是導(dǎo)致出現(xiàn)黃牛的陽性率最高，牦牛次之，犏牛最低的原因之一。

3.5 本試驗的不足之處主要表現(xiàn)為試驗動物數(shù)量相對較少，所取得的試驗數(shù)據(jù)也可能不能完全代表本地牛結(jié)核病的實際感染狀況，另外，試驗時期正值枯草季節(jié)，導(dǎo)致試驗牛的機體狀況沒有處于同一水平，可能影響試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，很難充分說明不同動物品種間的敏感性與差異性。另外國外通常撲殺試驗陽性牛，取病變組織或淋巴結(jié)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)來確診牛結(jié)核病。因條件所限，無法培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌，所以不能完全確診被檢牛群的陽性牛，只能認(rèn)為該牛群為結(jié)核陽性牛群。

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