單純皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和比較變態(tài)反應(yīng)在奶牛結(jié)核病檢測中的應(yīng)用

沈素芳，王曲直，趙洪進(jìn)，唐文紅，劉佩紅

（上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 長寧201103）

牛結(jié)核病是由牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌引起的重要人畜共患病，被列為國家二類動物疫病。牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌都能感染人和多種動物，尤其是牛，形成人與人之間、動物與動物之間，人和動物之間的相互傳播關(guān)系，造成嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。2000年第4次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告顯示，全國人口的結(jié)核感染率為44.5%［1］。一些研究認(rèn)為肺結(jié)核病人中約15%的結(jié)核病人是飲用了結(jié)核病牛的奶而發(fā)病［2］。1985年、1987年進(jìn)行的兩次全國奶牛抽樣調(diào)查結(jié)果，牛結(jié)核病患病率分別為5.83%和5.34%［3］。1979年、1985年、1990年3次全國結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示，由牛型分枝桿菌導(dǎo)致的結(jié)核病所占的比例分別為3.8%、4.2%、6.4%［3］。

目前，我國主要采用牛型分枝桿菌提純蛋白衍生物（purified protein derivative，PPD）進(jìn)行單純頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗（Single Intradermal Cervical Tuberculin，SICT），對檢出的陽性牛進(jìn)行隔離或撲殺。很多發(fā)達(dá)國家主要采用比較皮試變態(tài)反應(yīng)（Single Intradermal Comparative Cervical Tuberculin，SICCT）和γ－干擾素試驗進(jìn)行檢疫［4－5］。本試驗旨在對SICT、SICCT進(jìn)行比較，為我國的奶牛結(jié)核檢疫方法積累試驗數(shù)據(jù)，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 PPD 國產(chǎn)牛型PPD，購自國內(nèi)某生物疫苗有限公司。進(jìn)口牛型PPD和禽型PPD，購自荷蘭Prionics公司。

1.2 試驗用牛 上海某區(qū)1個奶牛場205頭試驗牛。

1.3 變態(tài)反應(yīng)試驗 SICT參照國家標(biāo)準(zhǔn)《動物結(jié)核病診斷技術(shù)（GB／T18645－2002）》進(jìn)行，僅采用進(jìn)口或國產(chǎn)牛型PPD進(jìn)行變態(tài)反應(yīng)試驗，國產(chǎn)牛型PPD劑量為2 000IU，進(jìn)口牛型PPD劑量為3 000 IU。分別于注射前和注射后72h測量皮膚厚度，并計算出皮厚差，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。SICCT參照OIE《動物疫苗和診斷手冊》中牛結(jié)核病診斷方法進(jìn)行［6］，在頸部皮內(nèi)分點(diǎn)注射牛型和禽型PPD，使用劑量為國產(chǎn)牛型PPD 2 000IU，進(jìn)口牛型PPD 3 000IU，禽型PPD2 500IU。分別于注射前和注射后72h測量皮膚厚度，并計算出皮厚差，依據(jù)OIE標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。為區(qū)別牛型和禽型PPD，在牛右頸側(cè)中部上三分之一處注射國產(chǎn)牛型PPD，下方間隔15～20cm注射進(jìn)口牛型PPD；在牛左頸側(cè)中部上三分之一處注射禽型PPD。比對右側(cè)國產(chǎn)牛型PPD和進(jìn)口牛型PPD的試驗結(jié)果，以評價國產(chǎn)牛型PPD和進(jìn)口牛型PPD的應(yīng)用效果；綜合右側(cè)國產(chǎn)牛型PPD和左側(cè)禽型PPD的試驗結(jié)果為國產(chǎn)牛型PPD的SICCT結(jié)果；綜合右側(cè)進(jìn)口牛型PPD和左側(cè)禽型PPD的試驗結(jié)果為進(jìn)口牛型PPD的SICCT結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 國產(chǎn)牛型PPD和進(jìn)口牛型PPD SICT的比對205頭牛中，國產(chǎn)牛型PPD檢出陽性牛13頭，陽性率6.34%（13／205）；進(jìn)口牛型PPD檢出陽性牛10頭，陽性率4.88%（10／205）。國產(chǎn)牛型 PPD和進(jìn)口牛型PPD的陽性牛符合數(shù)為8頭，陽性符合率為69.57%（8／11.5）；陰性符合數(shù)190頭，陰性符合率98.19%（190／193.5）。見表1。結(jié)果顯示，國產(chǎn)牛型PPD的陽性率略高于進(jìn)口牛型PPD，兩者的陽性符合率不到70%。

表1 國產(chǎn)牛型PPD和進(jìn)口牛型PPD的比對試驗 （單位：頭）

2.2 SICT和SICCT的比對

2.2.1 進(jìn)口牛型PPD SICT和SICCT的比對 205頭牛中，進(jìn)口牛型PPD SICT檢出陽性牛10頭，陽性率4.88%（10／205）；進(jìn)口牛型 PPD SICCT檢出陽性牛3頭，陽性率1.46%（3／205）。兩者之間的陽性符合數(shù)為3頭，陽性符合率為46.15%（3／6.5）；陰性符合數(shù) 195頭，陰性符合率 98.24%（195／198.5）。見表2。如果以進(jìn)口牛型 PPD 的SICCT為金標(biāo)準(zhǔn)，3頭陽性牛中，進(jìn)口牛型PPD的SICT陽檢出陽性牛3頭，敏感性為100%（3／3）；202頭進(jìn)口牛型PPD的SICCT陰性牛中，進(jìn)口牛型PPD SICT檢出陰性牛195頭，特異性為96.5%（195／202）。結(jié)果顯示，進(jìn)口牛型PPD的SICT具有很好的敏感性，陽性檢出率明顯高于SICCT，但與SICCT相比，特異性較低。

表2 進(jìn)口牛型PPD SICT和SICCT的比對試驗 （單位：頭）

2.2.2 國產(chǎn)牛型PPD SICT和SICCT的比對205頭牛中，國產(chǎn)牛型PPD SICT檢出陽性牛13頭，陽性率6.34%（13／205）；國產(chǎn)牛型PPD SICCT檢出陽性牛1頭，陽性率0.49%（1／205）。兩者之間的陽性符合數(shù)為1頭，陽性符合率為14.29%（1／7）；陰性符合數(shù)192頭，陰性符合率96.97%（192／198）。見表3。如果以國產(chǎn)牛型PPD的SICCT為金標(biāo)準(zhǔn)，1頭陽性牛中，國產(chǎn)牛型PPD的SICT檢出陽性牛1頭，敏感性為100%（1／1）；204頭國產(chǎn)牛型PPD的SICCT陰性牛中，國產(chǎn)牛型PPD SICT檢出陰性牛192頭，特異性為94.1%（192／204）。結(jié)果顯示，國產(chǎn)牛型PPD的SICT具有很好的敏感性，陽性檢出率明顯高于SICCT，但與SICCT相比，特異性較低。該結(jié)論與進(jìn)口牛型PPD的SICT和SICCT比對結(jié)果一致。

表3 國產(chǎn)牛型PPD SICT和SICCT的比對試驗 （單位：頭）

3 討論

本試驗對國產(chǎn)PPD和進(jìn)口PPD SICT進(jìn)行的比對試驗結(jié)果顯示，國產(chǎn)牛型PPD的陽性率略高于進(jìn)口牛型PPD，兩者的陽性符合率不到70%，分析原因：一是由于不同廠家的PPD產(chǎn)品本身存在質(zhì)量差異。在實際工作中，曾出現(xiàn)更換同一廠家的不同批次PPD時造成可疑牛數(shù)量大幅增加，經(jīng)2次復(fù)檢后又大部分轉(zhuǎn)陰的情況；二是由于SICT檢測方法存在較高的非特異性。很多物理性、化學(xué)性或生物性的因素會影響結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢測結(jié)果，尤其是生物性因素。比如牛白血病病毒、副結(jié)核桿菌、禽型分枝桿菌或非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）等微生物的感染都有可能造成假陽性的結(jié)果［7］。有研究表明，牛鼻腔分泌物中NTM的陽性分離率高達(dá)50.5%［8］。毛冉等在150頭健康牛的頜下淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)中分離出14株NTM。說明在自然環(huán)境和健康牛體內(nèi)中，NTM的存在比較普遍［9］。在一些研究中發(fā)現(xiàn)，STCT反應(yīng)陽性牛的病原菌分離中，非典型性分枝桿菌占分離株的81.5%，而牛型分枝桿菌僅占18.5%［10］。付少剛等在2009年～2011年，通過SICT從銀川地區(qū)1 867頭奶牛中檢出陽性牛22頭，對病料進(jìn)行抗酸染色、細(xì)菌培養(yǎng)及PCR檢測，未發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌［11］。第四次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告顯示，人間NTM的感染率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，1984年、1985年為4.2%，1990年為4.9%，2000年為11.1%。NTM的耐藥率高達(dá)83.7%［1］。迄今尚未證實NTM可以通過人進(jìn)行傳播，但可通過動物傳染給人［12］。人間NTM感染率的上升是否揭示了動物群體NTM感染率的上升有待進(jìn)一步研究。

在本試驗中，我們將SICT和SICCT進(jìn)行了比較分析，結(jié)果顯示SICCT的陽性率明顯低于SICT的陽性率，SICCT與SICT的陽性符合率低于50%。這是因為SICCT排除了一部分禽型PPD反應(yīng)陽性牛，提高了牛結(jié)核檢測的特異性。國內(nèi)有研究者將SICT和SICCT進(jìn)行比較分析，證明了SICCT在不降低敏感度的同時，提高了牛結(jié)核檢疫的特異性［13］。SICCT是許多發(fā)達(dá)國家進(jìn)行牛結(jié)核病檢測的依據(jù)，在歐盟國家廣泛應(yīng)用［6］。美國等國家均以比較變態(tài)反應(yīng)作為撲殺結(jié)核陽性牛的依據(jù)［14］。SICT雖然特異性較差，但具有較高的敏感性，在結(jié)核病流行地區(qū)，采用SICT對全群進(jìn)行普檢，有利于結(jié)核感染牛的早期檢出，加快結(jié)核病控制的步伐。但在結(jié)核病已達(dá)到控制或穩(wěn)定控制的地區(qū)，僅僅靠單一的SICT，常出現(xiàn)較多的非特異性干擾，不利于結(jié)核病的凈化。這可能是因為在牛型分枝桿菌流行為主導(dǎo)的奶牛場，禽型結(jié)核分枝桿菌流行情況相對較輕；而在對牛型分枝桿菌達(dá)到控制或凈化的奶牛場，禽型結(jié)核分枝桿菌或其他非致病性分枝桿菌陽性率較高［15］。

除了皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)，OIE推薦的結(jié)核病檢測方法還包括抗原特異性γ－干擾素試驗［6］。美國、加拿大、澳大利亞、新西蘭等多個國家均利用γ－干擾素試驗輔助診斷牛結(jié)核，取得了良好效果［16－17］。一些成功消滅牛結(jié)核病發(fā)達(dá)國家的經(jīng)驗顯示，當(dāng)牛群的結(jié)核病始終保持低水平發(fā)生的情況下，在保持傳統(tǒng)皮試檢測的同時，應(yīng)當(dāng)逐漸重視起在撲殺過程中對病牛身上的病原菌分離以及對分離菌株的從基因水平上的分離鑒定，也就是要將分子流行病學(xué)引入到控制牛結(jié)核病的策略中來。

我們認(rèn)為，在奶牛結(jié)核病已達(dá)到控制或穩(wěn)定控制的地區(qū)，可以采用SICCT作為日常監(jiān)測的主要手段，同時，可以引入γ－IFN試驗、細(xì)菌分離等方法作為SICCT的補(bǔ)充。同時，還應(yīng)根據(jù)不同地區(qū)結(jié)核病的流行情況和風(fēng)險分析結(jié)果，劃定未控制區(qū)、控制區(qū)、穩(wěn)定控制區(qū)和凈化區(qū)，結(jié)合檢疫、撲殺、消毒等綜合性防控措施及分子流行病學(xué)分析等方法，制訂凈化根除的近期計劃和長遠(yuǎn)規(guī)劃，逐步控制和消除結(jié)核病對人民身體健康和畜牧業(yè)發(fā)展的危害。

［1］全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組.第四次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2002，25（1）：3－7.

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