二種牛型提純結(jié)核菌素變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果比較

衛(wèi)龍興，王國(guó)賢，盛岳山，戴連群* ，洪云超，韓岳榮

(1.上海市奉賢區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海201400;2.上海市奉賢區(qū)莊行鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，上海201415;3.上海市奉賢區(qū)奉城鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，上海201411)

結(jié)核病曾經(jīng)是人類(lèi)歷史上最猖獗的傳染病之一，它是一種由結(jié)核分枝桿菌引起的、人和多種動(dòng)物共患的、古老而復(fù)雜的慢性傳染病?？菇Y(jié)核藥物的出現(xiàn)，才使這一疾病有所緩解，但由于結(jié)核病的生理特性和復(fù)雜的社會(huì)因素，加之近年來(lái)各國(guó)對(duì)結(jié)核病的忽視，使結(jié)核病重新成為了全球性的的人類(lèi)健康問(wèn)題，全球每年因結(jié)核病死亡的人數(shù)達(dá)200余萬(wàn)人，而發(fā)病數(shù)更是超過(guò)了800萬(wàn)人[1-2]，成為了世界范圍內(nèi)的頭號(hào)殺手。我國(guó)是結(jié)核病嚴(yán)重流行的國(guó)家，其發(fā)病率和死亡率均僅次于印度而居世界第二位，結(jié)核病也因此成為了我國(guó)重點(diǎn)防控的傳染病之一。結(jié)核病牛是人類(lèi)結(jié)核病的主要傳染源，但對(duì)于結(jié)核病牛的檢測(cè)方法，目前世界上普遍采用世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的提純結(jié)核菌素(PPD)皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)PPD試驗(yàn))[3]，我國(guó)也不例外。但采用這一方法檢測(cè)結(jié)核病牛易受到PPD非特異性反應(yīng)的干擾而造成誤判。為了解和分析國(guó)內(nèi)外不同廠家生產(chǎn)的牛型PPD的反應(yīng)性，試驗(yàn)選擇了國(guó)產(chǎn)和荷蘭產(chǎn)二種牛型PPD，對(duì)轄區(qū)內(nèi)兩家不同規(guī)模奶牛場(chǎng)的100頭青年奶牛進(jìn)行了一次皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)的結(jié)果比較。

1 材料與方法

1.1 參試牛只 隨機(jī)選取某存欄奶牛2000頭以上大型奶牛場(chǎng)12～18月齡青年母牛85頭和某存欄奶牛200頭左右小型奶牛場(chǎng)12～18月齡青年母牛15頭，共100頭青年母牛。

1.2 參試PPD 國(guó)產(chǎn)牛型提純結(jié)核菌素(簡(jiǎn)稱(chēng)國(guó)產(chǎn)PPD)，哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，批號(hào):201003，使用前用滅菌注射用水稀釋成每mL含PPD 20000 IU。荷蘭產(chǎn)牛型提純結(jié)核菌素(簡(jiǎn)稱(chēng)荷蘭產(chǎn)PPD)，荷蘭Prionics公司，批號(hào):102115，每mL含PPD 30000 IU。

1.3 方法

1.3.1 牛只處理 對(duì)所有參試牛只按照(《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)》GB/T18645-2002)PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)的要求，在每頭牛左右兩側(cè)的頸中部上三分之一處進(jìn)行剪毛(面積大于10 cm×10 cm)、量取原皮厚、作好記錄、局部消毒。采用英國(guó)進(jìn)口全金屬自動(dòng)進(jìn)量連續(xù)皮內(nèi)注射器，分別在每頭參試牛的左側(cè)頸部剪毛消毒處皮內(nèi)注射國(guó)產(chǎn)PPD 0.1 mL(2000 IU)、在右側(cè)頸部剪毛消毒處皮內(nèi)注射荷蘭產(chǎn)PPD 0.1 mL(3000 IU)，并確認(rèn)注射有效。

1.3.2 試驗(yàn)判定 72 h后觀察反應(yīng)，測(cè)量每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的皮厚，每頭牛對(duì)應(yīng)作好記錄，并計(jì)算與原皮的皮厚差。國(guó)產(chǎn)和荷蘭產(chǎn)二種牛型PPD均按照(《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)》GB/T18645-2002)牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定[3]。

陽(yáng)性反應(yīng):局部有明顯的炎性反應(yīng)，皮厚差大于或等于4.0 mm者，判為陽(yáng)性反應(yīng)，記作(+)。疑似反應(yīng):局部炎性反應(yīng)不明顯，皮厚差大于或等于2.0 mm、小于4.0 mm者，判為可疑，記作(±)。陰性反應(yīng):無(wú)炎性反應(yīng)，皮厚差在2.0 mm以下者，判為陰性，記作(-)。

1.3.3 細(xì)菌培養(yǎng)復(fù)核試驗(yàn) 對(duì)PPD試驗(yàn)判定結(jié)果為陽(yáng)性的牛只，撲殺后采取肺門(mén)淋巴結(jié)樣品送上海市疾病預(yù)防控制中心作結(jié)核桿菌細(xì)菌培養(yǎng)和分離鑒定[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 二種PPD試驗(yàn)結(jié)果(反應(yīng)點(diǎn))比較 二種牛型PPD各進(jìn)行了100個(gè)皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)點(diǎn)，結(jié)果國(guó)產(chǎn)PPD有30個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)、荷蘭產(chǎn)PPD有20個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分別出現(xiàn)不同程度的變態(tài)反應(yīng)。經(jīng)綜合判定后，共有10個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)被判為(+)、40個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)被判為(±)。綜合判定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 國(guó)產(chǎn)和荷蘭產(chǎn)PPD試驗(yàn)結(jié)果(反應(yīng)點(diǎn))比較 單位:頭

分析表1發(fā)現(xiàn):在皮內(nèi)注射劑量荷蘭產(chǎn)PPD＞國(guó)產(chǎn)PPD的情況下，10個(gè)(+)和40個(gè)(±)反應(yīng)試驗(yàn)點(diǎn)，國(guó)產(chǎn)PPD與荷蘭產(chǎn)PPD的(+)反應(yīng)比例為7∶3，(±)反應(yīng)比例為23∶17;從出現(xiàn)反應(yīng)的試驗(yàn)點(diǎn)數(shù)量分析，國(guó)產(chǎn)PPD的皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果明顯大于荷蘭產(chǎn)PPD。

2.2 相同判定結(jié)果牛只不同PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)結(jié)果的比較 對(duì)30個(gè)國(guó)產(chǎn)PPD和20個(gè)荷蘭產(chǎn)PPD出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)點(diǎn)的牛只，依據(jù)二種PPD的皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)判定結(jié)果進(jìn)行比較(表2)。

表2 國(guó)產(chǎn)與荷蘭產(chǎn)PPD判定結(jié)果(牛只)比較 單位:頭

分析表2發(fā)現(xiàn)，二種PPD的50個(gè)反應(yīng)點(diǎn)集中在36頭試驗(yàn)牛，其中有9頭牛國(guó)產(chǎn)PPD和荷蘭產(chǎn)PPD的判定結(jié)果相符[2頭(+)、7頭(±)]，占出現(xiàn)反應(yīng)牛只總數(shù)的25%。有20頭牛國(guó)產(chǎn)PPD的判定結(jié)果＞荷蘭產(chǎn)PPD，占出現(xiàn)反應(yīng)牛只總數(shù)的55.6%;其中5頭國(guó)產(chǎn)PPD判定結(jié)果為(+)的牛只，荷蘭產(chǎn)PPD判定結(jié)果為4頭(±)和1頭(-);15頭國(guó)產(chǎn)PPD判定結(jié)果為(±)的牛只，荷蘭產(chǎn)PPD判定結(jié)果均為(-)。另有7頭牛國(guó)產(chǎn)PPD的判定結(jié)果＜荷蘭產(chǎn)PPD，占出現(xiàn)反應(yīng)牛只總數(shù)的19.4%;其中1頭國(guó)產(chǎn)PPD判定結(jié)果為(±)的牛只，荷蘭產(chǎn)PPD判定結(jié)果為(+);6頭國(guó)產(chǎn)PPD判定結(jié)果為(-)的牛只，荷蘭產(chǎn)PPD判定結(jié)果為(±)。

結(jié)果顯示:36頭出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)的試驗(yàn)牛中，除9頭牛(25%)二種PPD的判定結(jié)果相符外，其余27頭牛(75%)二種PPD的判定結(jié)果出現(xiàn)了不同程度的分離，而且國(guó)產(chǎn)PPD判定結(jié)果＞荷蘭產(chǎn)PPD的牛只數(shù)顯著大于荷蘭產(chǎn)PPD判定結(jié)果＞國(guó)產(chǎn)PPD 的牛只數(shù)(20∶7)。

表3 二種PPD試驗(yàn)結(jié)果分離的牛只分類(lèi)比較單位:頭

對(duì)27頭國(guó)產(chǎn)和荷蘭產(chǎn)二種PPD試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)分離牛只判定結(jié)果的分類(lèi)比較見(jiàn)表3。結(jié)果顯示:在國(guó)產(chǎn)PPD試驗(yàn)結(jié)果＞荷蘭產(chǎn)PPD的5頭(+)和15頭(±)牛中，荷蘭產(chǎn)PPD僅4頭牛表現(xiàn)(±)，其余16頭牛均為(-);而在荷蘭產(chǎn)PPD試驗(yàn)結(jié)果＞國(guó)產(chǎn) PPD的1頭(+)和6頭(±)牛中，國(guó)產(chǎn)PPD只有1頭牛的試驗(yàn)結(jié)果為(±)，其他均為(-)。

綜合表2和表3的比較結(jié)果，在國(guó)產(chǎn)PPD的使用劑量(2000 IU)小于荷蘭產(chǎn)PPD(3000 IU)的情況下，國(guó)產(chǎn)PPD的皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果(牛頭數(shù))顯著大于荷蘭產(chǎn)PPD。

經(jīng)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析T檢驗(yàn)的方法計(jì)算，國(guó)產(chǎn)和荷蘭產(chǎn)二種PPD變態(tài)反應(yīng)成對(duì)試驗(yàn)皮厚差之間的P值為0.00298，二種PPD試驗(yàn)結(jié)果差異極顯著(P＜0.01)。

2.3 復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果 采用結(jié)核桿菌細(xì)菌培養(yǎng)的方法對(duì)PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)判定結(jié)果(+)牛只進(jìn)行復(fù)核。經(jīng)對(duì)8頭PPD試驗(yàn)(+)牛只[2頭二種PPD均為(+)、5頭國(guó)產(chǎn) PPD(+)、1頭荷蘭產(chǎn)PPD(+)]肺門(mén)淋巴結(jié)樣品進(jìn)行結(jié)核桿菌培養(yǎng)，結(jié)果全部為陰性[4-5]。結(jié)果提示PPD試驗(yàn)(+)結(jié)果可能為非特異性反應(yīng)。

3 討論與小結(jié)

由于試劑采購(gòu)及試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)等因素影響，試驗(yàn)過(guò)程未能采用PPD國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品或國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品與二種參試PPD的判定結(jié)果進(jìn)行比較，但通過(guò)對(duì)二種參試PPD相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果的系統(tǒng)分析與比較，結(jié)果顯示國(guó)產(chǎn)PPD反應(yīng)性顯著大于荷蘭產(chǎn)PPD，可能影響牛結(jié)核病檢疫結(jié)果的判定，應(yīng)在臨床應(yīng)用中注意復(fù)核。

PPD試驗(yàn)陽(yáng)性樣品結(jié)核桿菌細(xì)菌培養(yǎng)復(fù)核結(jié)果顯示，二種PPD診斷液均存在較強(qiáng)的非特異性反應(yīng)，而且雖然國(guó)產(chǎn)PPD診斷液的使用劑量較小，但反應(yīng)結(jié)果卻顯著大于荷蘭產(chǎn)PPD診斷液。綜合試驗(yàn)結(jié)果證明:國(guó)產(chǎn)PPD診斷液的非特異性反應(yīng)較強(qiáng)，應(yīng)注重多種檢測(cè)方法的綜合判定。

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[3]毛開(kāi)榮，陳向經(jīng)，關(guān)孚時(shí).動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)(GB/T 18645-2002)[S].

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