腦蛋白水解物注射液對腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)保護作用研究

溫世斌 劉國軍 夏金花 哈小琴

大面積腦梗死多由頸內(nèi)動脈及大腦中動脈閉塞引起，氧化應激損傷在腦缺血后腦損傷中起重要作用［1－2］。腦蛋白水解物注射液是一種神經(jīng)保護劑，所含生物活性低分子肽可通過血－腦脊液屏障，能有效抑制腦梗死后自由基的生成，抑制神經(jīng)細胞的激活和凋亡，預防神經(jīng)元變性。該研究旨在觀察腦蛋白水解物注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用。

1 材料和方法

1.1 動物 成年健康雄性 Wistar大鼠80只，SPF級，體質(zhì)量（300±20）g，5～6月齡，由甘肅中醫(yī)學院實驗動物中心提供。大鼠置常規(guī)實驗室適應環(huán)境1周。

1.2 主要試劑和儀器 腦蛋白水解物注射液（商品名:施普善，EVER Neuro Pharma GmbH公司，奧地利）；還原型谷胱甘肽（GSH）及一氧化氮合酶（NOS）、考馬斯亮藍蛋白、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒均購自武漢博士德生物制品有限公司；分散式勻漿機（DY89－II，深圳點晶科學儀器有限公司）；可調(diào)式水平離心機（Sigma公司）；酶標板（Costar 9018系列，美國康寧公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 大鼠腦缺血再灌注損傷模型的制備:應用線栓法經(jīng)右側(cè)頸總動脈插線建立右側(cè)大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）再灌注模型［3］。另隨機取10只大鼠作為假手術組，僅分離頸總動脈和頸內(nèi)動脈不進行線栓。將造模成功且成活的大鼠隨機分為模型組、腦蛋白水解物注射液低劑量注射組、中劑量注射組和高劑量注射組，每組10只。另20只大鼠備用。給藥劑量:再灌注后立即給藥，模型組經(jīng)尾靜脈注射0.9%（質(zhì)量濃度）生理鹽水600μL，腦蛋白水解物注射液低劑量注射組、中劑量注射組和高劑量注射組分別經(jīng)尾靜脈注射300、600、1200μL腦蛋白水解物注射液注射液。

1.3.2 觀察指標:分別于大鼠清醒后、再灌注24 h后根據(jù)Longa等5級評分方法［4］進行神經(jīng)功能評分:0分:正?；顒樱?分:不能充分伸展左前肢；2分:向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分:向左側(cè)傾倒；4分:不能自己行走或意識障礙。選擇神經(jīng)功能評分在2～3分且伴左側(cè) Horner征陽性的大鼠用于實驗。提高軀體擺動實驗（EBST）:大鼠清醒24h后，使大鼠倒懸離地約5cm，記錄大鼠頭向兩側(cè)方偏轉(zhuǎn)的次數(shù)（以大鼠頭部偏離身體中線約10°為準），重復該步驟10次。向缺血對側(cè)（左側(cè)）的旋轉(zhuǎn)次數(shù)＞75%即可認為造模成功［5］。

1.3.3 大鼠腦組織SOD、NOS活性及 GSH 、MDA含量的檢測:各組大鼠于再灌注后24h后，取大腦中動脈供應區(qū)相同部位的腦組織，等重稱取，加入9倍4℃生理鹽水溶液制成10%組織勻漿，以2500r／min離心10min（低溫、離心半徑＝150mm），吸取上清，按試劑盒說明書步驟操作，分別測定各組SOD、NOS活性及GSH和MDA含量。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料采用均數(shù)±標準差表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能比較 模型組神經(jīng)功能評分高于假手術組，而對側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)百分比則低于假手術組（均P＜0.05）；與模型組比較，應用腦蛋白水解物注射液治療后，腦蛋白水解物注射液低、中和高3個劑量組較模型組神經(jīng)功能評分降低，對側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)百分比顯著升高（均P＜0.05）。腦蛋白水解物注射液中、高劑量組神經(jīng)功能評分較低劑量組顯著降低，對側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)百分比則顯著升高（均P＜0.05）；但中等劑量注射組與高劑量注射組間比較，其神經(jīng)功能評分和對側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)百分比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分和對側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)百分比比較 （，n＝10）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分和對側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)百分比比較 （，n＝10）

注:低、中、高劑量注射組指腦蛋白水解物注射液低、中、高劑量注射組；與模型組比較，＊P＜0.05；與低劑量注射組比較，＃P＜0.05

分組 神經(jīng)功能評分 對側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)百分比模型組3.40±0.80 0.40±0.05假手術組 1.35±0.35＊ 0.95±0.35＊低劑量注射組 3.10±0.65＊ 0.70±0.09＊中劑量注射組 2.70±0.60＊＃ 0.80±0.15＊＃高劑量注射組 2.60±0.55＊＃ 0.85±0.20＊＃F值107.8 114.3 P值 ＜0.05 ＜0.05

2.2 各組大鼠腦組織SOD和GSH活性及MDA含量比較 模型組與假手術組比較SOD活性和GSH含量顯著下降，而MDA含量則顯著升高（均P＜0.05）；與模型組比較，腦蛋白水解物注射液高、中、低劑量組SOD活性和GSH含量顯著升高，MDA含量顯著降低（均P＜0.05）。腦蛋白水解物注射液中、高劑量組SOD活性和GSH含量較低劑量組升高，MDA含量則顯著降低（均P＜0.05）；但中等劑量注射組與高劑量注射組間比較，各指標之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。具體結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠腦組織中SOD、MDA、GSH含量比較 （，n＝10）

表2 各組大鼠腦組織中SOD、MDA、GSH含量比較 （，n＝10）

注:低、中、高劑量注射組指腦蛋白水解物注射液低、中、高劑量注射組；與模型組比較，＊P＜0.05；與低劑量注射組比較，＃P＜0.05

分組 SOD（U／mg protein） MDA（nmol／mg protein） GSH（nmol／L）模型組175.25±21.20 29.43±8.15 23.50±2.92假手術組 256.38±31.50＊ 14.65±4.50＊ 38.20±3.84＊低劑量注射組 216.27±23.34＊ 15.57±5.58＊ 31.50±4.24＊中劑量注射組 246.39±25.44＊＃ 13.23±3.25＊＃ 35.69±5.36＊＃高劑量注射組 252.48±26.40＊＃ 12.45±3.40＊＃ 36.60±5.90＊＃F值123.4 112.7 115.6 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表3 各組大鼠腦組織中總NOS、iNOS、cNOS含量比較 （，n＝10，U／mg protein）

表3 各組大鼠腦組織中總NOS、iNOS、cNOS含量比較 （，n＝10，U／mg protein）

注:低、中、高劑量注射組指腦蛋白水解物注射液低、中、高劑量注射組；與模型組比較，＊P＜0.05；與低劑量注射組比較，＃P＜0.05

分組 總NOS iNOS cNOS模型組4.76±1.30 3.92±0.64 1.55±0.47假手術組 1.95±0.50＊ 1.82±0.40＊ 0.85±0.26＊低劑量注射組 2.98±0.55＊ 2.92±0.42＊ 1.50±0.44＊中劑量注射組 2.45±1.18＊＃ 2.28±0.40＊＃ 1.17±0.43＊＃高劑量注射組 2.26±1.15＊＃ 2.12±0.35＊＃ 0.94±0.37＊＃F值126.8 118.4 106.7 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 各組大鼠腦組織總NOS、誘導型NOS（iNOS）、構(gòu)建型NOS（cNOS）活性的影響 模型組與假手術組比較TNOS、iNOS、cNOS均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，腦蛋白水解物注射液各劑量組TNOS、iNOS、cNOS活性均明顯降低（P＜0.05）；腦蛋白水解物注射液中、高劑量組TNOS、iNOS和cNOS活性較低劑量組均顯著降低（P＜0.05）；中等劑量組與高劑量組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05，表3）。

3 討論

腦蛋白水解物注射液（Cerebrolysin）含有生物活性肽，有獨特的神經(jīng)保護和神經(jīng)營養(yǎng)作用，在腦卒中病理級聯(lián)反應的各個環(huán)節(jié)中具有保護神經(jīng)細胞的作用。通過對腦蛋白水解物注射液抗氧自由基的研究為其在腦血管病治療中的應用提供了新的思路和方法［6－8］。尤其神經(jīng)保護和神經(jīng)營養(yǎng)類藥物對于大腦缺血后的修復以及預后評價等至關重要。腦蛋白水解物注射液已經(jīng)應用于臨床并在救治急性腦血管意外中具有較好的療效，但有關其抗自由基損傷機制的研究報道較少。本研究通過建立大鼠腦缺血再灌注模型，觀察腦蛋白水解物注射液對腦缺血再灌注腦組織中GSH、MDA、SOD、NOS含量的影響，旨在探討腦蛋白水解物注射液是否具有抑制腦缺血再灌注后氧自由基生成和過氧化反應的作用，結(jié)果表明腦蛋白水解物注射液能顯著提高腦缺血再灌注后SOD活力和降低MDA含量，從而起到腦組織保護的作用。

大量生成的氧自由基在缺血性腦損傷時可破壞組織及體液細胞及大分子，繼而引起細胞凋亡［9］，腦缺血再灌注后，自由基生成增多，自由基清除動態(tài)平衡破壞，導致細胞膜的脂質(zhì)過氧化反應，造成組織損傷繼續(xù)惡化，組織損傷再引起氧自由基的過多生成，是一個惡性循環(huán)過程［10－11］。超過生理量的NO釋放可以通過自由基而產(chǎn)生神經(jīng)毒性。對于缺血再灌注所形成的腦組織損傷，NOS的活性增強，表明 NO合成釋放增加［12］，SOD、MDA、GSH對于清除氧自由基有重要作用，可反映體內(nèi)氧自由基的水平和組織損傷程度［13］。NOS各類型的活性則可反映組織損傷的階段，是反映機體抗氧化能力的重要指標［14－15］。本研究測定了大鼠腦缺血再灌注24h后腦組織中SOD、GSH和MDA的變化，結(jié)果顯示，與假手術組比較，模型組SOD活性和GSH含量明顯降低，MDA含量則明顯升高，表明模型組大鼠體內(nèi)氧自由基的生成水平增高，組織損傷程度加重。缺血再灌注后腦組織各類型NOS活性均明顯升高，再次證實缺血再灌注后腦內(nèi)自由基大量產(chǎn)生以及抗脂質(zhì)過氧化功能的降低，自由基清除能力下降是其重要的損傷機制。經(jīng)腦蛋白水解物注射液干預后，腦蛋白水解物注射液能顯著升高缺血再灌注后大鼠腦組織SOD和NOS酶活性及GSH水平，降低MDA水平，表明腦蛋白水解物注射液可拮抗腦損傷后的自由基過多生成，對腦損傷后的自由基損傷具有保護作用。本研究結(jié)果還顯示，在各劑量干預組SOD和NOS酶活性、GSH含量并未隨腦蛋白水解物注射液劑量的增加而增加，MDA含量亦未見明顯的劑量效應關系，表明腦蛋白水解物注射液達到一定劑量之后，其保護效應不再增強。

綜上所述，大鼠腦缺血再灌注并經(jīng)尾靜脈注射腦蛋白水解物注射液治療后，大鼠神經(jīng)行為功能得到明顯改善，其原因可能與腦蛋白水解物注射液增強細胞抗氧化系統(tǒng)功能或清除自由基有關，最終起到保護腦組織的作用。但關于腦蛋白水解物注射液的應用療程及其抗凋亡作用等方面尚需進一步研究。

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