HPLC法測定沙棘葉、果實、枝條中齊墩果酸和熊果酸的含量

滕曉萍，王宏昊，花圣卓，劉 洋，關(guān) 銘

（1.高原圣果沙棘制品有限公司，北京 100036；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，長春 130021）

沙棘（Hippophae rhamnoidesL·）是胡頹子科（E1aeagnaceae）沙棘屬的灌木或小喬木。別名醋柳、黑刺、酸刺、沙棗、其察日嘎納（蒙名）、達(dá)普（藏名）、吉汗（維吾爾名）。沙棘是蒙古族和藏族常用中藥材，具有較高的藥用價值。依據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，沙棘具有利肺、升陽、健脾、養(yǎng)胃、活血化瘀、消炎生肌等藥理功效［1］。沙棘中含有齊墩果酸和熊果酸成分。齊墩果酸具有護(hù)肝降酶、降低血脂、抗炎利尿、抗腫瘤等作用［2］。熊果酸具有顯著的抗致癌、抗促癌和免疫作用［3］，具有降低血脂、防止動脈粥樣硬化及由其引起的心腦血管病作用［4］。

目前，使用HPLC法同時測定中藥中齊墩果酸和熊果酸含量的報道較多［5-15］，但對沙棘葉及枝條中齊墩果酸和熊果酸的含量測定至今尚未見文獻(xiàn)報道。為開發(fā)沙棘葉新的藥用資源，本研究建立了同時測定沙棘葉中齊墩果酸和熊果酸含量的HPLC法，為分析、評價沙棘及其相關(guān)制品以及有關(guān)質(zhì)量控制，提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-20ATVP高效液相色譜儀及LC-solution工作站（日本島津公司）；AB-E 分析天平（METTLER TOLEDO）；紫外掃描儀（日本島津UVmini-1240）；超聲清洗器（KQ 3200DE 昆山市超聲儀器有限公司）。

齊墩果酸對照品（中國藥品生物制品檢定所批號：110709-200505）；熊果酸對照品（四川維克奇生物科技有限公司）；甲醇（色譜純 天津市四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）；娃哈哈純凈水；乙醇（分析純 北京化工廠）。

2 色譜條件

色譜柱：Shim-pack型C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-0.2%磷酸溶液（87∶13）；檢測波長210nm；柱溫30℃；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL。對照品及樣品分析的HPLC 圖譜見圖1、圖2、圖3。

3 溶液制備

3.1 對照品溶液的配制

精密稱取齊墩果酸對照品1.4mg，熊果酸對照品1.5mg，分別置于10mL 容量瓶中。加入乙醇溶解并稀釋至刻度，作為對照品溶液。齊墩果酸和熊果酸對照品溶液濃度均分別為0.14mg/mL 和0.15mg/mL。

3.2 供試品溶液的配制

稱取沙棘葉25.0g，適當(dāng)粉碎。以300mL95%乙醇回流提取2 次，第1 次回流2.0h，第2 次回流1.5h，回流溫度為95℃。提取液經(jīng)濃縮、烘干、真空干燥后得沙棘葉提取物粉末。精密稱取上述沙棘葉提取物粉末44.8mg，置于10.0mL 容量瓶，加8.0mL 乙醇，超聲提取20min，加入乙醇定溶至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，用0.45μm 微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

4 結(jié)果

4.1 線性關(guān)系考察

取上述對照品溶液，分別以5.0、7.5、10.0、12.5、15.0μL進(jìn)樣分析。以峰面積對進(jìn)樣量進(jìn)行線性回歸，齊墩果酸和熊果酸的回歸方程分別為：Y=410182x+13635，r=0.9994；Y=400000X+17667，r=0.9993，結(jié)果表明齊墩果酸和熊果酸在0.7～2.1μg和0.75～2.25μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

4.2 精密度實驗

精密吸取對照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，分別測定峰面積值，計算出齊墩果酸RSD%為1.33%，熊果酸的RSD%為2.63%。表明方法精密度良好。

4.3 重復(fù)性實驗

精密稱取沙棘葉提取物粉末6 份，按“3”項下方法制備溶液并進(jìn)樣測定。根據(jù)峰面積值，計算齊墩果酸的RSD%為2.39%，熊果酸的RSD%為1.54%，方法重現(xiàn)性良好。

4.4 穩(wěn)定性試驗

取樣品按“3”項下方法制成供試品溶液，按照“2”項下色譜條件在0h、2h、4h、8h、12h 測定，用外標(biāo)法計算其含量。結(jié)果為供試品溶液中齊墩果酸和熊果酸的RSD%分別為1.33%和2.63%，表明供試品溶液在12h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定，可滿足測定需要。

4.5 加樣回收率實驗

準(zhǔn)確稱取已知齊墩果酸和熊果酸含量的沙棘葉提取物粉末6份，分別加入齊墩果酸和熊果酸對照品混合溶液適量，配制加標(biāo)樣品溶液。進(jìn)樣測定齊墩果酸和熊果酸的含量，計算回收率。齊墩果酸和熊果酸的平均加樣回收率分別為99.88%（RSD=2.95%）和100.80%（RSD=2.81%）。

4.6 含量測定

取沙棘葉適量，按供試品制備方法處理，按照上述HPLC條件測定，采用外標(biāo)法測定沙棘葉中齊墩果酸含量為0.081%，熊果酸含量為0.221%，即三萜酸總含量為0.302%。

為全面考察三萜酸在沙棘各部位的分布情況，使用上述條件和方法，也測定沙棘枝條和沙棘果實中三萜酸成分含量，結(jié)果見下表1。

表1 三萜酸在沙棘中的含量分布

5 討論

（1）沙棘是一種藥食同源植物，在我國分布廣泛，資源豐富，其應(yīng)用前景可觀。但沙棘葉的利用率較低，截至目前為止，尚未見有關(guān)沙棘葉中齊墩果酸和熊果酸含量測定的報道。本研究首次建立了同時測定沙棘葉中齊墩果酸和熊果酸含量的HPLC方法。結(jié)果表明，該方法具有良好的準(zhǔn)確度、精密度和重現(xiàn)性。

（2）HPLC 法測定齊墩果酸和熊果酸的含量，采用紫外檢測器時，需要選擇適宜的檢測波長。由于二者的最大吸收波長均在202nm左右，若檢測波長小，溶劑系統(tǒng)（甲醇-水）的截止波長（205nm）接近檢測波長，則造成基線噪音大，基線平衡困難；若檢測波長大，則二者的吸收值太低，響應(yīng)因子小，靈敏度降低，同樣影響組分的檢測。因此，本研究結(jié)果證明，采用HPLC法測定齊墩果酸和熊果酸含量時，以選擇210nm作為檢測波長較適宜。

（3）齊墩果酸和熊果酸互為三萜類同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)十分相似，分離困難較大。經(jīng)比較甲醇-水、甲醇-磷酸、甲醇-冰醋酸和乙腈-水體系后，選擇甲醇-0.2%磷酸體系作為流動相，分離效果較好。

采用本文建立的方法同時測定沙棘葉中兩者的含量，操作簡便、手段先進(jìn)、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

在科研上，目前基本只注重對于沙棘黃酮的研究，已有大量關(guān)于沙棘黃酮的先進(jìn)提取、分離方法的文獻(xiàn)報道，而針對其他活性成分的報道甚少。

目前，沙棘中三萜酸和生物堿類成分的深入研究和開發(fā)利用尚屬空白，對沙棘的果實、莖、葉等各部位中三萜酸和生物堿類成分的提取分離、含量測定以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面研究尚未見研究報道。本研究是高原圣果沙棘制品有限公司和吉林大學(xué)共同的研究課題，著重研究我國資源豐富、易于收集且易于儲存的沙棘葉為研究對象，對其中的三萜酸和生物堿類活性成分的提取工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，以期為沙棘中三萜酸和生物堿類成分的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步開發(fā)沙棘藥品和沙棘保健品提供參考依據(jù)。

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