丹酚酸B通過Akt－eNOS通路對大鼠心肌缺血／再灌注損傷保護(hù)作用的研究＊

周 丹 權(quán) 偉 關(guān) 月 朱艷榮 郭 超 王艷華 奚苗苗 文愛東

第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科 （西安710032）

缺血性心臟病是當(dāng)今世界威脅人類健康的首敵。隨著冠狀動(dòng)脈內(nèi)溶栓和冠脈搭橋等內(nèi)外科治療手段的廣泛應(yīng)用，繼之出現(xiàn)的心肌缺血／再灌注 （myocardia1ischemia／reperfusion，MI／R）損傷日益受到心臟病學(xué)家的高度重視。中藥治療MI／R損傷療效確切、前景良好。許多從中藥中分離得到的化合物都具有抗MI／R損傷的作用，其中對于丹參心肌保護(hù)作用的研究最為引人關(guān)注。

丹參（Radix Salviae Miltiorrhizae）為唇型科植物丹參的干燥根及根莖。丹參的有效成分復(fù)雜，主要有丹參酚、丹參素、丹參酮等?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，丹參的不同提取物具有抗氧化、抗炎、擴(kuò)血管、抑制凋亡等作用［1－4］。丹酚酸 B（Salvianolic acid B，Sal B）是丹參的水溶性成分，有研究表明Sal B對大鼠MI／R損傷具有保護(hù)作用［5，6］，但其分子作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制大鼠 MI／R損傷模型，觀察Sal B對大鼠 MI／R損傷的保護(hù)作用，并進(jìn)一步研究Akt－eNOS通路在Sal B心肌保護(hù)中的可能作用，為Sal B用于MI／R損傷的防治提供新的理論依據(jù)。

1 材 料 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級雄性健康SD大鼠40只，體質(zhì)量250～270g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)（環(huán)境溫度24℃，濕度60%～70%），術(shù)前12h禁食，自由飲水。將大鼠隨機(jī)分為4個(gè)組，即假手術(shù)組、模型組、Sal B低及高劑量組，每組10只。

1.2 主要藥品與試劑 Sal B（貴州迪達(dá)科技有限公司）；肌酸激酶同工酶（creatine kinase－MB，CK－MB）（上海西唐生物科技有限公司）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒（南京建成生物工程研究所）；2，3，5－氯化三苯基四氮唑藍(lán)（Tetrazolium chloride，TTC）染色劑（中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司）；伊文思藍(lán)（Evans Blue，EB）（美國Sigma－Aldrich公司）。RIPA buffer蛋白裂解液和苯甲基磺酰氟化物（碧云天生物技術(shù)研究所）；兔抗鼠Akt和p－Akt（Ser473）單克隆抗體、兔抗鼠eNOS和p－eNOS（Cell Signaling Technology公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔IgG（北京中山生物技術(shù)公司）；ECL底物發(fā)光顯色試劑盒（HRP發(fā)光）（北京雷根生物技術(shù)有限公司）。

1.3 主要儀器 HX－100E小動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司）；TDZ4A－WS低速臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；COOLPIX S1型照相機(jī)（Nikon公司，日本）；680型酶標(biāo)儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像儀（BIO－RAD公司）；5417型低溫高速離心機(jī)（Eppendorf公司）。

2 方 法 2.1 給藥方法 假手術(shù)組和模型組大鼠均于再灌注開始時(shí)經(jīng)頸靜脈給予生理鹽水（2mL／kg）；Sal B低、高劑量組大鼠均于再灌注開始時(shí)經(jīng)頸靜脈給予Sal B溶液（20，60mg／kg）。

2.2 造模方法 大鼠稱重后，2mL／kg腹腔注射3%戊巴比妥鈉，仰臥位固定，連接心電圖監(jiān)測，氣管插管并接呼吸機(jī)（頻率：75次／min；潮氣量：8～9mL；吸：呼＝1：2），胸骨左緣旁縱行切開第3～5肋間做橫行切口，剪開并挑起心包，暴露心臟，以左心耳與肺動(dòng)脈圓錐交界處的左冠狀動(dòng)脈前降支（Left anterior descending coronary aery，LAD）為標(biāo)志，于左心耳下方1～2mm處進(jìn)針、穿線（橫跨左冠狀動(dòng)脈前降支），將一小硅膠管從絲線兩端穿入，穩(wěn)定10min后結(jié)扎，缺血30min后，再灌注3h結(jié)束。成功標(biāo)準(zhǔn)［7］：結(jié)扎LAD后心電圖II導(dǎo)聯(lián)ST段出現(xiàn)弓背向上抬高，T波高聳等為缺血成功；放松結(jié)扎線后，抬高的ST段下降1／2以上為再灌注成功。假手術(shù)組動(dòng)物只穿線，不結(jié)扎，其余兩組均進(jìn)行30min缺血和3h再灌注。

2.3 心肌梗死面積測定［8］再灌注3h后，再次結(jié)扎各組大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支，從頸動(dòng)脈迅速注入3%EB溶液2 mL，待大鼠口唇及四肢末梢皮膚藍(lán)染后迅速摘除心臟，濾紙吸除心室腔中殘余染液，－80℃凍存。取出后自心尖向心底平行房室溝方向?qū)⑵淝谐上嗟群穸鹊?片，2%TTC溶液（pH＝7.4）37℃孵育10min，4%多聚甲醛固定過夜。染色后白色代表梗死區(qū)（area of necrosis，AN），紅色代表缺血但未梗死區(qū)，藍(lán)色代表正常區(qū)，危險(xiǎn)區(qū)（area at risk，AAR）為紅色和白色面積之和［9，10］。采用Image－Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析。梗死程度采用梗死區(qū)面積（AN）與危險(xiǎn)區(qū)面積（AAR）的比值表示。

2.4 血清生化指標(biāo)測定 再灌注3h后，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，離心（4000r／min）12min，試劑盒檢測 CK－MB和LDH的活性。

2.5 Akt、p－Akt及eNOS、p－eNOS蛋白表達(dá)測定 每組取4只大鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后迅速剪取左心室前壁心肌組織，立即放入－80℃冰箱中保存。標(biāo)本取齊后在冰上剪碎、加入適量的裂解液提取心肌總蛋白，4℃下20000g離心20min，取上清，放入－20℃冰箱中備用。Western blot檢測 Akt、p－Akt及eNOS、p－eNOS蛋白表達(dá)。取等量蛋白進(jìn)行SDS－PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫封閉1h后，加入相應(yīng)兔抗鼠一抗（Akt 1：1000，p－Akt 1：1000或 p－eNOS 1：1000，eNOS 1：1000），4℃ 孵育過夜。加入羊抗兔HRP標(biāo)記二抗（1：2000稀釋），室溫孵育1h。加入ECL顯色液，曝光顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析。

3 結(jié) 果 3.1 Sal B對缺血／再灌注大鼠心肌梗死面積的影響 大鼠缺血30min再灌注3h后，模型組動(dòng)物心肌出現(xiàn)明顯的梗死，梗死區(qū)面積與危險(xiǎn)區(qū)面積的比為（58.09±2.76）%。與假手術(shù)組相比，模型組動(dòng)物心肌梗死面積顯著增加（P＜0.05），提示 MI／R損傷模型制作成功。而Sal B低、高劑量組梗死區(qū)面積與危險(xiǎn)區(qū)面積的比分別為（40.41±4.26）%，（29.99±5.41）%。與模型組相比，Sal B低、高劑量組（20，60 mg／kg）均能明顯降低 MI／R損傷大鼠心肌梗死面積（P＜0.05，P＜0.05），見圖1。

圖1 Sal B對MI／R損傷大鼠心肌梗死面積的影響?！鱌＜0.05vs假手術(shù)組；▲P＜0.05vs模型組

3.2 Sal B對缺血／再灌注大鼠血清CK－MB和LDH的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清CK－MB和LDH水平明顯增加（P＜0.05）。Sal B高劑量組大鼠血清CK－MB和LDH水平明顯下降，與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。Sal B低劑量組大鼠血清LDH水平明顯下降，與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而Sal B低劑量組大鼠血清CK－MB水平有下降趨勢，但與模型組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

表1 Sal B對大鼠心肌梗死面積、血清CK－MB和LDH的影響（±s，n＝10）

表1 Sal B對大鼠心肌梗死面積、血清CK－MB和LDH的影響（±s，n＝10）

注：△P＜0.05vs假手術(shù)組；▲P＜0.05vs模型組

組別 劑量（mg／kg） CK－MB（ng／mL） LDH（U／L）假手術(shù)組 ／24.26±6.30 29457.50±663.06模型組 ／ 88.51±32.20△ 62961.12±3506.10△Sal B低劑量組 20 63.83±29.85◇ 41429.33±5759.77▲Sal B高劑量組 60 27.71±8.52▲ 29822.17±1709.51▲

3.3 Sal B對缺血／再灌注大鼠心肌 Akt、p－Akt及eNOS、p－eNOS蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測顯示，各組Akt、eNOS蛋白表達(dá)均無明顯差異（P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組p－Akt／Akt及p－eNOS／eNOS相對灰度值增加（P＜0.01），提示 MI／R損傷可引起p－Akt及p－eNOS蛋白表達(dá)升高。與模型組比較，Sal B低、高劑量組 p－Akt／Akt及 p－eNOS／eNOS相對灰度值均顯著增加（P＜0.01），表明Sal B低、高劑量組（20，60mg／kg）均可增加Akt及eNOS的磷酸化水平而使其活化，見圖2。

圖2 Sal B對MI／R損傷大鼠心肌Akt、p－Akt及eNOS、p－eNOS蛋白表達(dá)的影響。△P＜0.01vs假手術(shù)組；▲P＜0.01vs模型組

4 討 論 隨著溶栓、冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈內(nèi)成形術(shù)等血管再灌注療法的應(yīng)用，可通過恢復(fù)缺血組織的供血有效挽救瀕死心肌［11］。但是再灌注受缺血組織血管再通時(shí)間限制并存在再灌注損傷等問題。大量報(bào)道表明，心肌缺血期間的一些變化已為再灌注損傷的發(fā)生奠定了基礎(chǔ)，再灌注損傷是缺血損傷的延續(xù)、擴(kuò)大和惡化［12］。因此，尋找能夠有效防治MI／R損傷的藥物成為醫(yī)藥學(xué)家的研究熱點(diǎn)。越來越多的證據(jù)表明，Sal B對MI／R損傷具有保護(hù)作用，但其具體分子機(jī)制不清。本研究在觀察Sal B對MI／R損傷保護(hù)作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了Akt－eNOS信號通路在其中的關(guān)鍵作用。

梗死面積被認(rèn)為是衡量MI／R損傷的金標(biāo)準(zhǔn)［13］。由于心肌梗死是不可逆損傷，通常采用AN／AAR百分比來說明缺血／再灌注的損傷程度。在各組大鼠缺血程度基本一致的情況下，AN／AAR百分比越大，說明心肌梗死面積越大，心肌損傷程度越嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Sal B能顯著減少心肌梗死面積，并且隨濃度升高梗死面積明顯下降，提示Sal B對MI／R損傷大鼠的心肌具有保護(hù)作用。長期心肌缺血會(huì)導(dǎo)致心肌梗死、心肌細(xì)胞死亡，心肌缺血時(shí)，心肌酶CK－MB和LDH被認(rèn)為是心肌細(xì)胞受損程度的重要標(biāo)志酶［14］。心肌細(xì)胞受損后，血清中CKMB和LDH的水平明顯升高。本實(shí)驗(yàn)證明，Sal B 60mg／kg可顯著抑制MI／R大鼠血清LDH和CK－MB水平的增加，Sal B 20mg／kg可顯著抑制 MI／R大鼠血清LDH水平的增加，進(jìn)一步提示Sal B對MI／R損傷大鼠的心肌具有保護(hù)作用。

Akt－eNOS是再灌注損傷補(bǔ)救酶（RISK）信號轉(zhuǎn)到通路的組成之一［15］，通過影響下游相關(guān)蛋白的表達(dá)，對心臟產(chǎn)生保護(hù)作用。該通路有多種效應(yīng)分子，而Akt處在這一通路的中心環(huán)節(jié)，也是最主要的靶酶，只有磷酸化的Akt才能具有抗凋亡、蛋白合成及促細(xì)胞生存等活性［16］。研究表明缺血再灌注時(shí)eNOS可發(fā)揮保護(hù)作用，eNOS的高表達(dá)參與血流的調(diào)節(jié)，抑制血管痙攣、減少炎性細(xì)胞的浸潤及防止細(xì)胞內(nèi)鈣超載等再灌注損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［17］。高峰［18］等人發(fā)現(xiàn)胰島素可激活 PI3K－Akt－eNOS信號通路，活化的Akt可使eNOS磷酸化激活，進(jìn)而增加NO的生成、抑制TNF－α的生成，從而減輕 MI／R損傷引起的炎癥反應(yīng)，達(dá)到保護(hù)心臟的作用。本研究發(fā)現(xiàn)Sal B 20 mg／kg和60mg／kg均可增加Akt及eNOS的磷酸化水平而使其活化，由此可推斷出Sal B激活A(yù)kt－eNOS信號通路，使效應(yīng)蛋白Akt磷酸化增多，進(jìn)一步激活了下游靶目標(biāo)eNOS使其磷酸化，從而發(fā)揮其對心臟的保護(hù)作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示Sal B可通過激活A(yù)kt、eNOS的磷酸化而減輕大鼠 MI／R損傷，但是Akt－eNOS信號通路是通過何種機(jī)制被激活以及該通路活化后如何發(fā)揮心肌保護(hù)作用，還有待進(jìn)一步研究。

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