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    超聲波輔助提取中華苦荬菜多酚工藝優(yōu)化及不同干燥方式對(duì)其得率的影響*

    2013-11-21 10:02:16石同同陳瑩瑩王頡孫劍鋒鄭乾魏
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2013年10期
    關(guān)鍵詞:冷凍干燥提取液真空

    石同同,陳瑩瑩,王頡,孫劍鋒,鄭乾魏

    1(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北 保定,071000)2(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,河北保定,071000)

    中華苦荬菜(Ixeris chinensis(Thunb.ex Thunb.)Nakai)含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和生理活性物質(zhì),具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健作用,也是一種藥食共用的植物[1]。中華苦荬菜在我國(guó)分布廣泛,野生資源豐富,食用、藥用歷史悠久,其化學(xué)成分及藥理作用復(fù)雜[2-3]。多酚類物質(zhì)是一族在結(jié)構(gòu)中含有酚的化合物,屬于植物的次生代謝產(chǎn)物[4],有研究報(bào)道,植物多酚具有清除體內(nèi)自由基、抗凝血、抗炎、防癌以及預(yù)防心血管疾病等多種作用。中華苦荬菜中所含成分十分復(fù)雜,常用提取多酚的方法有煎煮法、回流法、浸漬法,它們具有提取時(shí)間長(zhǎng)、提取率低且多酚等活性成分損失量大等缺點(diǎn)。超聲波破碎細(xì)胞提取法是近幾年新興的提取方法,具有選擇性高、提取時(shí)間短、提取率高、消耗溶劑少等優(yōu)點(diǎn)[5],本試驗(yàn)采用響應(yīng)面優(yōu)化法確定中華苦荬菜多酚超聲提取最佳條件,并對(duì)真空冷凍干燥、紅外干燥、自然陰干、烘干及自然曬干的中華苦荬菜多酚得率進(jìn)行了測(cè)定。

    1 材料和方法

    1.1 材料與儀器

    中華苦荬菜,采自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi),經(jīng)河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科技學(xué)院馮大嶺教授鑒定,沒(méi)食子酸,福林酚,無(wú)水乙醇,碳酸鈉均為市售分析純。

    kq-500de型細(xì)胞超聲破碎儀,昆山市超聲儀器有限公司;WFZ-UV-2800紫外-可見分光光度計(jì),尤尼科儀器有限公司;真空冷凍干燥機(jī);HW-3型紅外干燥箱;DL-101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱,天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司;TB-215D分析天平,賽多利斯股份有限公司(德國(guó),感量為十萬(wàn)分之一)。

    1.2 中華苦荬菜處理方法

    新鮮中華苦荬菜洗凈,50℃條件下烘干至恒重,粉碎后過(guò)40目,準(zhǔn)確稱取中華苦荬菜干粉2.000 g,放入一定體積的乙醇溶液,放入超聲波破碎儀,提取后抽濾,抽濾液用60%乙醇定容到50 mL容量瓶得到中華苦荬菜提取液,再將此提取液稀釋10倍,精密稱取試驗(yàn)中稀釋后的提取液1 mL,分別加入0.5 mL福林試劑、2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%Na2CO3溶液,定容至10 mL,室溫下反應(yīng)2 h。在760 nm出測(cè)定反應(yīng)液的吸光度。

    1.3 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線確定

    采用 Folin-ciocalteu 法測(cè)定總多酚含量[6-7]。稱取25 mg沒(méi)食子酸,加入到25 mL去離子水中,得到1 mg/mL的沒(méi)食子酸溶液。吸取5 mL 1 mg/mL的沒(méi)食子酸溶液,定容至50 mL容量瓶中,即得0.1 mg/mL 的沒(méi)食子酸溶液,然后配成 0,20,40,60,80,100 μg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)液分別標(biāo)號(hào)0~6。取不同標(biāo)樣沒(méi)食子酸溶液1 mL,分別加入0.5 mL福林試劑、2 mL 10%Na2CO3溶液,定容至10 mL,室溫下反應(yīng)2 h,以0號(hào)管為空白用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定各溶液在760 nm處吸光度,以吸光度(y)為縱坐標(biāo),沒(méi)食子酸濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    1.4.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    準(zhǔn)確稱取處理后的中華苦荬菜干粉2.000 g,放入一定體積的乙醇溶液,放入超聲波破碎儀,分別加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇,按照不同的提取時(shí)間、不同的料液比進(jìn)行超聲提取,提取結(jié)束后抽濾,抽濾液用60%乙醇定容到50 mL容量瓶中。提取液按照1.2測(cè)定提取液吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算中華苦荬菜多酚得率,分別確定最適的乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間和料液比。

    1.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)及優(yōu)選

    根據(jù)乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間和料液比3個(gè)單因素試驗(yàn)所確定的水平范圍,使用Design-Expert 7.1.3為輔助手段設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn),選取Box-behnken模型,以多酚得率為響應(yīng)值,做三因素三水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)(5個(gè)中心點(diǎn))的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。確定中華苦荬菜最佳的提取條件。

    1.5 中華苦荬菜干燥方法的選擇

    1.5.1 真空冷凍干燥

    將采集的中華苦荬菜全草洗凈,放入真空冷凍干燥機(jī)的冷凍室,迅速降溫至-40℃,保持1 h。再將凍結(jié)的中華苦荬菜放入真空干燥室,干燥8h,至樣品質(zhì)量不再發(fā)生改變,取出凍干的中華苦荬菜粉碎后過(guò)40目,抽真空包裝后備用。

    1.5.2 紅外干燥

    將采集的中華苦荬菜全草洗凈放入HW-3型紅外干燥箱,干燥2 h,干燥結(jié)束取出粉碎后過(guò)40目,抽真空包裝后備用。

    1.5.3 陰干

    將采集的中華苦荬菜全草洗凈,放置到背陰處,48 h后干燥結(jié)束,將陰干的中華苦荬菜粉碎后過(guò)40目,抽真空包裝后備用。

    1.5.4 烘干

    將采集的中華苦荬菜全草洗凈,50℃條件下烘干至恒重,粉碎后過(guò)40目,抽真空包裝后備用。

    1.5.5 曬干

    將采集的中華苦荬菜全草洗凈,放到太陽(yáng)直射下,10 h后質(zhì)量不再發(fā)生變化,干燥結(jié)束粉碎后過(guò)40目,抽真空包裝后備用。

    1.6 多酚得率的計(jì)算

    根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法將所測(cè)定的中華苦荬菜提取液的吸光度帶入回歸方程計(jì)算多酚的提取率。首先將所測(cè)得的吸光度帶入回歸曲線,計(jì)算此時(shí)所測(cè)定反應(yīng)液的多酚濃度x(μg/mL)。

    總得率z=x×500/(2×1 000×1 000)。

    其中,500為稀釋倍數(shù),2×1 000×1 000為稱取中華苦荬菜質(zhì)量(μg)。(此公式僅適用于此試驗(yàn))。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    根據(jù)沒(méi)食子酸不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液得到的吸光度,以吸光度(y)為縱坐標(biāo),沒(méi)食子酸濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明沒(méi)食子酸濃度在0~100 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。如圖1所示,回歸方程為y=0.011 2x+0.026 5,R2=0.995 7。

    圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

    2.2 超聲提取多酚單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率的影響

    精確稱取中華苦荬菜粉末2.000 g,在料液比1∶20(g∶mL),提取1 h條件下,分別加入體積分?jǐn)?shù)為30%、45%、60%、75%、95%的乙醇溶液,進(jìn)行超聲破碎提取1 h后,按1.2方法測(cè)定,并計(jì)算多酚得率。試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

    圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)得率的影響Fig.2 Effects of alcohol concentration on extraction rate

    從圖2可知,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,多酚得率逐漸升高,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí),多酚的得率達(dá)到最大,總得率為1.91%,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時(shí),多酚得率開始下降,主要原因可能是隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的不斷增大,溶液的極性逐漸增大,而中華苦荬菜中多酚物質(zhì)的極性是基本恒定的,根據(jù)相似相溶原理,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增大到60%時(shí),如果再繼續(xù)增大,則提取液中因?yàn)樗畼O性增大導(dǎo)致提取率開始下降,從而使多酚得率降低。因此選擇適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%、60%、75%。

    2.2.2 超聲提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響

    精確稱取中華苦荬菜粉末2.000 g,在料液比1∶20(g∶mL),乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí),分別提取15、30、45、60、75、90 min,按照 1.2 方法進(jìn)行測(cè)定,并計(jì)算多酚得率。試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

    圖3 超聲時(shí)間對(duì)得率的影響Fig.3 Effects of processing time on extraction rate

    從圖3可知,隨著超聲提取時(shí)間的增加,多酚得率逐漸升高,當(dāng)超聲提取60 min時(shí),中華苦荬菜多酚得率達(dá)到最大,此時(shí)得率為1.93%。當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)60 min時(shí),多酚得率差異性不顯著,這可能是超聲提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng),導(dǎo)致中華苦荬菜細(xì)胞組織破壞,一些不溶性的雜質(zhì)溢出,從而阻止了多酚成分的溶出。因此選擇適宜的超聲時(shí)間為45、60、75 min。

    2.2.3 料液比對(duì)多酚得率的影響

    精確稱取中華苦荬菜粉末2.000 g,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為 60%時(shí)提取 1 h,分別考察料液比 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(g∶mL)對(duì)中華苦荬菜多酚得率的影響。試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

    圖4 料液比對(duì)得率影響Fig.4 Effects of material-liquid ratio on extraction rate

    從圖4可知,隨著料液比的逐漸增大,中華苦荬菜多酚得率逐漸增大,當(dāng)料液比為1∶20(g∶mL)時(shí),總得率達(dá)到最大,為1.89%。繼續(xù)增大料液比,多酚的得率差異性不顯著。分析原因可能是由于在超聲波的作用下,中華苦荬菜中所含多酚類物質(zhì)已經(jīng)最大限度溶出,當(dāng)料液比進(jìn)一步增大時(shí),其他雜質(zhì)進(jìn)入浸提液,從而阻止了多酚成分的溶出。因此選擇最適的料液比為 1∶15、1∶20、1∶25(g∶mL)。

    2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化中華苦荬菜多酚提取工藝

    根據(jù)Box-behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,綜合單因素所得試驗(yàn)結(jié)果,選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間和料液比3個(gè)因素,采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法,因素水平設(shè)計(jì)見表1。

    表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factorlal levels of RSD

    表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 2 Design scheme and results of central composite test

    應(yīng)用Design-Expert軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析,得到中華苦荬菜多酚得率與各因素變量的模型Y=1.87+0.18A+0.056B+0.071C+0.067AB-0.013AC+0.030BC-0.36A2-0.057B2-0.18C2。

    運(yùn)用軟件對(duì)17個(gè)響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析得到方差分析表,如表3所示,整體模型P<0.01,該二次方程模型達(dá)到了極顯著水平,并且失擬項(xiàng)不顯著說(shuō)明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好。分析表3可知A乙醇濃度對(duì)多酚得率達(dá)到極顯著水平(P<0.01),C料液比對(duì)多酚得率達(dá)到顯著水平(P<0.05),二次項(xiàng)A2、C2對(duì)中華苦荬菜多酚得率曲面效應(yīng)極顯著,交叉項(xiàng)對(duì)多酚得率 的影響也較顯著。

    表3 方差分析表Table 3 Analysis of extraction rate of flavonoids

    2.4 響應(yīng)面曲面分析

    根據(jù)回歸方程,做出響應(yīng)面圖(見圖5~圖7),考察所擬合的響應(yīng)面的形狀,分析乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間以及料液比對(duì)多酚得率的影響。

    圖5 F(A,B)響應(yīng)面立體圖Fig.5 F(A,B)Response surface perspective view

    圖6 F(A,C)響應(yīng)面立體圖Fig.6 F(A,C)Response surface perspective view

    從圖5~圖7可見,乙醇體積分?jǐn)?shù)是影響多酚得率的主要因素,料液比對(duì)其得率的影響次之,超聲時(shí)間對(duì)其得率的影響較小。在模型濃度的范圍內(nèi)選擇出發(fā)點(diǎn),按照模型使用快速上升法進(jìn)行優(yōu)化,可得中華苦荬菜多酚提取的最佳方案為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,超聲時(shí)間60 min,料液比1∶20(g∶mL),在此工藝條件下,中華苦荬菜多酚得率的預(yù)測(cè)值為1.86%。

    圖7 f(B,C)響應(yīng)面立體圖Fig.7 F(B,C)Response surface perspective view

    2.5 最佳提取條件驗(yàn)證試驗(yàn)

    為檢測(cè)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性,采用上述優(yōu)化條件乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,超聲時(shí)間60 min,料液比1∶20(g∶mL),實(shí)際平均得率為1.85%,與理論值基本相符。

    2.6 不同方法干燥的中華苦荬菜多酚得率測(cè)定

    按照中華苦荬菜多酚的最佳超聲提取條件,分別測(cè)定真空冷凍干燥、紅外干燥、陰干、烘干以及曬干的中華苦荬菜中多酚得率,如圖8所示。

    圖8 干燥方式對(duì)得率的影響Fig.8 Effects of drying methods on extraction rate

    試驗(yàn)結(jié)果表明,真空冷凍干燥的中華苦荬菜多酚得率最高,為3.22%,曬干的中華苦荬菜多酚得率最低,為1.23%,干燥效果依次為凍干>紅外干燥>烘干>陰干>曬干。由此可知,直射光線及空氣中長(zhǎng)時(shí)間放置對(duì)多酚得率的影響非常大,容易使多酚含量因氧化而降低。真空冷凍干燥中華苦荬菜在干燥前始終處于低溫(凍結(jié)狀態(tài)),同時(shí)冰晶均勻分布于中華苦荬菜中,升華過(guò)程不會(huì)因脫水而發(fā)生濃縮現(xiàn)象,避免了由水蒸氣產(chǎn)生泡沫、多酚的氧化等副作用,因此真空冷凍干燥方式所得的多酚得率最高。紅外干燥時(shí)中華苦荬菜內(nèi)部水分的濕擴(kuò)散與熱擴(kuò)散方向是一致的,從而加速了水分內(nèi)擴(kuò)散的過(guò)程,也即加速了中華苦荬菜的干燥進(jìn)程,因此短時(shí)間內(nèi)就可干燥結(jié)束,從而避免多酚含量的降低。但是考慮到真空冷凍干燥能耗高,干燥時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn),而紅外干燥具有干燥效率高,活性成分損失少等優(yōu)點(diǎn),因此建議生產(chǎn)上采用紅外干燥的方式,同樣能得到較高的多酚含量。

    3 結(jié)論

    采用超聲波輔助提取技術(shù)對(duì)中華苦荬菜多酚進(jìn)行提取,通過(guò)單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析對(duì)超聲波提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,得出較優(yōu)工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,超聲時(shí)間60 min,料液比1∶20(g∶mL),此時(shí)多酚得率可達(dá)1.85%。用最佳提取條件分別對(duì)真空冷凍干燥、紅外干燥、自然陰干、烘干及自然曬干的中華苦荬菜中的多酚得率進(jìn)行測(cè)定,試驗(yàn)結(jié)果表明真空冷凍干燥的中華苦荬菜多酚得率高,為3.22%,曬干的中華苦荬菜多酚得率低,為1.23%,不同干燥方式得率的大小依次為凍干(3.22%)>紅外干燥(3.05%)>烘干(1.98%)>陰干(1.75%)>曬干(1.23%)。

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