C3a、C5a及其受體在IgA腎病發(fā)病中的作用*

段喜梅，張 穎，劉 璐，周雅麗，權(quán)松霞，邢國蘭#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科 鄭州 450052 2)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室 鄭州 450052

1968年Berger首次發(fā)現(xiàn)IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)以來，IgAN已成為世界范圍內(nèi)最常見的一種原發(fā)性腎小球腎炎。由于其診斷依賴腎組織活檢,各地報道[1]發(fā)病率的不同部分原因與腎組織活檢指征的差異有關(guān)，在我國IgAN占所有原發(fā)性腎小球疾病的58.2%[2]。IgAN并非良性過程，30%～40% IgAN患者在20 a內(nèi)會進展為終末期腎臟病[3]。IgAN確切的發(fā)病機制至今尚不清楚。有文獻[4]報道，補體通過旁路途徑、甘露聚糖結(jié)合凝集素途徑活化后參與IgAN的發(fā)病過程。而補體活化過程中產(chǎn)生的過敏毒素C3a、C5a片段是補體致炎的主要分子，該研究旨在探討C3a、C5a補體片段在IgAN發(fā)病中的作用，為IgAN的治療提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1病例選擇選取2011年1月至12月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科住院行腎穿刺活檢術(shù)并經(jīng)臨床和病理診斷為IgAN患者的石蠟標本共83例，按照病理分級標準[5]分為Ⅱ級(30例)、Ⅲ級(30例)、Ⅳ級(23例)；選取10例同期在泌尿外科住院行腎腫瘤切除術(shù)患者遠離腫瘤的腎組織石蠟標本作為正常對照，所選的腎組織病理學(xué)證實均無明顯病變。同時收集IgAN患者的血、尿標本作為病例組，10例同期在ICU住院且確診為膿毒血癥患者的血、尿標本作為陽性對照，10例健康人血、尿標本作為陰性對照，血液離心后取上層血清-80 ℃保存。各組IgAN患者的年齡、臨床指標情況見表1。

1.2免疫組化法檢測腎組織中C3a、C5a及其受體(C3aR、C5aR)的表達各組石蠟組織3 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，水化，PBS洗3次(每次3 min),微波熱修復(fù)法進行抗原修復(fù),體積分數(shù)3%去離子過氧化氫封閉15 min，分別滴加1100稀釋的小鼠抗人C3a、C5a單克隆抗體(Abcam，英國)、兔抗人C3aR多克隆抗體(Santa Cruz，美國)以及11 000稀釋的小鼠抗人C5aR單克隆抗體(Abd Serotec,英國)，4 ℃孵育過夜，37 ℃復(fù)溫30 min，PBS洗3次(每次3 min)，加PV-9000(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)試劑1，37 ℃孵育20 min，PBS洗3次(每次3 min)，加PV-9000試劑2，37 ℃孵育25 min，PBS洗3次(每次3 min)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染20 s，脫水、透明后封片。每張切片選取10個不重疊視野，400倍鏡下計數(shù)陽性細胞，計算陽性細胞百分比[6]。

1.3ELISA法檢測血清、尿液C3a、C5a水平C3a、C5a ELISA檢測試劑盒購于美國BD公司，采用雙抗夾心ELISA法分別檢測各組血清、尿液中C3a、C5a水平。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析比較各組C3a、C5a、C3aR和C5aR在腎組織中的陽性細胞百分比和血清、尿液中C3a、C5a水平，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；IgAN病理損傷級別與臨床指標的關(guān)系、腎組織中C3a、C5a、C3aR和C5aR的表達與臨床指標的關(guān)系采用Spearman或Pearson相關(guān)分析。檢驗水準α=0.05。

表1 IgAN患者臨床資料

1 mmHg=0.133 kPa；CRP：C-反應(yīng)蛋白；SCr：血肌酐。

2 結(jié)果

2.1IgAN患者病理損傷級別與臨床指標的相關(guān)分析IgAN病理損傷級別與24 h尿蛋白定量、SCr、β2微球蛋白、CRP、平均動脈壓呈正相關(guān)，而與血清IgA、C3無關(guān)，見表2。

表2 IgAN病理損傷級別與臨床指標的相關(guān)分析結(jié)果

2.2C3a、C3aR在各組腎臟組織中的表達情況正常腎組織中可在腎小管上皮細胞見C3aR表達，IgAN患者的腎組織中C3aR主要表達在腎小管上皮細胞、包曼囊壁細胞、系膜細胞以及間質(zhì)中的浸潤細胞，且隨病理損傷級別增加而表達增強；C3a在腎組織中表達部位與C3aR表達部位一致，且隨病理損傷級別增加而表達增強。結(jié)果見圖1和表3。

2.3C5a、C5aR在各組腎臟組織中的表達情況正常腎組織腎小管上皮細胞C5aR少量表達，而IgAN患者腎組織中腎小球上皮細胞、包曼囊壁細胞、小管上皮細胞、內(nèi)皮細胞、系膜細胞、間質(zhì)浸潤細胞以及新月體中均表達C5aR，且隨病理損傷級別增加而表達增強；C5a在腎臟組織的表達部位與C5aR表達部位一致，且隨病理損傷級別增加而表達增強。結(jié)果見圖2和表4。

圖1 C3a、C3aR在各組腎臟組織中的表達情況(PV，×200)

表3 各組腎臟組織中C3a、C3aR陽性細胞百分比比較 %

*與正常對照組比較，P<0.05；#Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級組間兩兩比較，P均<0.05。

表4 各組腎臟組織中C5a、C5aR陽性細胞百分比比較 %

*與正常對照組比較，P<0.05；#Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級組間兩兩比較，P均<0.05。

圖2 C5a、C5aR在各組腎臟組織中的表達情況(PV，×200)

2.4IgAN患者腎組織中C3a及C3aR與臨床指標的相關(guān)分析C3a及C3aR與平均動脈壓、24 h尿蛋白定量、SCr、CRP呈正相關(guān)，而與血清IgA、C3無關(guān)，見表5。

2.5IgAN患者腎組織中C5a及C5aR與臨床指標的相關(guān)分析C5a及C5aR與平均動脈壓、24 h尿蛋白定量、SCr、CRP呈正相關(guān)，而與血清IgA、C3無關(guān)，見表6。

2.6各組血清中C3a、C5a水平比較結(jié)果見表7。

2.7各組尿液中C3a、C5a水平比較結(jié)果見表8。

表5 IgAN患者腎組織中C3a及C3aR與臨床指標的相關(guān)分析結(jié)果

表6 IgAN患者腎組織中C5a及C5aR與臨床指標的相關(guān)分析結(jié)果

表7 各組血清中C3a、C5a水平比較 μg/L

*與陰性對照組比較，P<0.05。

表8 各組尿液中C3a、C5a水平比較 μg/L

*與陰性對照組比較,P<0.05；#Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級組間兩兩比較，P均<0.05。

3 討論

C3a、C5a是補體活化過程中產(chǎn)生的最主要的致炎裂解產(chǎn)物， C3a、C5a與其特異性受體C3aR、C5aR結(jié)合發(fā)揮致炎作用。C3a、C5a參與了自身免疫性疾病、移植腎排斥、紫癜性腎炎、哮喘等多種炎癥性疾病的發(fā)病過程。C3a、C5a在IgAN發(fā)病機制中的作用報道甚少。Abou-Ragheb等[7]研究發(fā)現(xiàn)IgAN和過敏性紫癜患者血清C3a水平升高。Janssen等[8]的研究同樣也顯示IgAN患者的血漿C3a水平顯著升高，但是長期隨訪后發(fā)現(xiàn)，與腎功能穩(wěn)定的患者相比，腎功能進行性惡化的患者血清C3a水平卻并沒有呈現(xiàn)升高趨勢。該研究結(jié)果顯示，IgAN患者血清C3a、C5a水平并沒有隨著病理損傷的加重而呈現(xiàn)升高的趨勢；有意思的是，該研究中不同病理損傷級別IgAN患者尿液中C3a、C5a水平不同，且腎組織中C3a、C5a陽性細胞百分比隨著病理損傷的加重而出現(xiàn)升高的趨勢。此結(jié)果提示尿液中C3a、C5a可能來自腎臟補體系統(tǒng)的局部激活；補體的局部激活在腎臟組織損傷中起著重要作用。Boor等[9]研究發(fā)現(xiàn)C3a、C5a,尤其是C5a在腎臟疾病中參與腎小管上皮細胞損傷以及小管間質(zhì)纖維化的生物學(xué)過程。該研究免疫組化結(jié)果顯示，IgAN患者系膜細胞、小管上皮細胞、間質(zhì)浸潤細胞中C3a、C5a的表達隨著病理損傷程度的加重而增強，提示C3a、C5a參與IgAN的炎癥及纖維化過程。

C3a、C5a誘發(fā)的炎癥反應(yīng)是其特異性受體C3aR、C5aR介導(dǎo)的。Abe等[10]用原位雜交法觀察25例系膜增生性腎小球腎炎患者(其中15例為IgAN)C5aR在腎組織的表達情況，結(jié)果顯示C5aR 蛋白和mRNA在腎小球的表達增強，且與系膜細胞增生和系膜基質(zhì)增多的程度呈正相關(guān)；而在腎小管及小管間質(zhì)，C5aR mRNA表達水平與小管萎縮程度及患者SCr水平呈正相關(guān)，而C5aR蛋白表達水平卻與小管萎縮程度無關(guān)。研究[11]證實C3aR在正常腎組織小管上皮細胞表達，而在系膜區(qū)沒有表達。該研究在不同病理損傷級別IgAN患者的腎組織中檢測到C3aR、C5aR表達，與正常對照組腎組織相比，這些表達出現(xiàn)在除腎小管上皮細胞以外的系膜細胞以及間質(zhì)中一些浸潤細胞，且隨病理損傷程度的加重而增強。提示C3a、C5a與C3aR、C5aR結(jié)合后，參與IgAN腎小球、腎小管以及腎小管間質(zhì)病變的損傷過程。它們在腎組織中的表達情況與臨床指標的相關(guān)分析結(jié)果也證明了這一點，說明C3a、C5a、C3aR和C5aR在腎組織的表達增強，對腎組織造成不同程度的損傷，可能參與IgAN的進展。

綜上所述，IgAN患者血液、腎臟局部補體活化產(chǎn)生的C3a、C5a參與IgAN的發(fā)病，在IgAN腎臟病理損傷過程中起促進作用，從而影響疾病的進展。該研究結(jié)果為尋找IgAN治療的新靶點提供了理論依據(jù)。

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