艾葉乙酸乙酯提取物對HBV的抑制作用*

趙志鴻，侯迎迎，鄭立運(yùn)，王麗陽，王桂芳，張小俊，張壯麗

1)鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院 鄭州450052 2)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染至今仍是世界性的醫(yī)學(xué)難題，它是導(dǎo)致急性、慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要病因。目前臨床上抗HBV的藥物主要為干擾素和核苷類藥物，這兩類藥物在HBV感染的治療上均取得了比較好的療效[1]，但是有報道[2-3]干擾素適應(yīng)證范圍窄，不良反應(yīng)多；核苷類藥物停藥后易復(fù)發(fā)，長期使用易產(chǎn)生耐藥性和出現(xiàn)腎毒性、骨髓抑制等不良反應(yīng)。傳統(tǒng)中藥在長期治療乙型肝炎中體現(xiàn)了獨(dú)有的優(yōu)勢。艾葉為菊科多年生草本植物艾(ArtemisiaargyiLévl.etVant.)的干燥葉，其在我國大部分地區(qū)都有分布。傳統(tǒng)藥性理論認(rèn)為艾葉有理氣血、逐寒濕、溫經(jīng)血、安胎、殺蟲止癢等[4]作用。實(shí)驗(yàn)[5-6]證明其具有抗菌、抗病毒、平喘鎮(zhèn)咳祛痰、止血與抗凝血、抗過敏、鎮(zhèn)靜、護(hù)肝利膽及抗自由基等作用。作者觀察了艾葉乙酸乙酯提取物對HBV的作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1材料與儀器艾葉產(chǎn)自河南駐馬店，由河南中醫(yī)學(xué)院董誠明教授鑒定為菊科植物艾的干燥葉；HepG2.2.15細(xì)胞株由暨南大學(xué)生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地贈予，作者所在的研究室自行傳代培養(yǎng)。乙酸乙酯(分析純，北京化工廠)，拉米夫定[葛蘭素-史克制藥(蘇州)有限公司]，RPMI 1640培養(yǎng)基(北京索萊寶生物醫(yī)藥科技有限公司)，胰蛋白酶(美國Amersco公司)，MTT(美國Sigma公司)，G418(美國Invitrogen公司)，HBV核酸擴(kuò)增熒光定量檢測試劑盒(深圳匹基生物工程股份有限公司)，HBV表面抗原(HBsAg)ELISA診斷試劑盒、HBV e抗原(HBeAg)ELISA診斷試劑盒(上?？迫A生物技術(shù)有限公司)，DNA提取試劑盒(美國Omega公司)。生物安全柜 Hfsafe-1200TE ClassⅡ Type B2、水套式二氧化碳培養(yǎng)箱 HF160 W(香港力康發(fā)展有限公司)，酶標(biāo)儀 168-1000XC(美國BIO RAD公司)，熒光PCR檢測儀(美國Roche LightCycler1.5)，全自動滅菌器 HVE-50(日本HIRAYAMA)。

1.2艾葉乙酸乙酯提取物的制備稱取粉碎后的艾葉1 kg，置于燒瓶中，加入乙酸乙酯6 000 mL，室溫浸泡12 h，加熱回流2 h，回流結(jié)束后靜置15 min，濾過；濾渣加乙酸乙酯4 000 mL，再次回流2 h，濾過；合并濾液，減壓濃縮后，于60 ℃真空干燥8 h，得艾葉乙酸乙酯提取物21.5 g。

1.3艾葉乙酸乙酯提取物對HepG2.2.15細(xì)胞毒性的測試參照文獻(xiàn)[7]。當(dāng)細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液，以2×104mL-1接種于96孔板，每孔100 μL，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后分別加入含0.0(對照)、1.6、8.0、40.0、200.0和500.0 mg/L艾葉乙酸乙酯提取物的RPMI 1640培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔。培養(yǎng)72 h后，每孔加入20 μL含結(jié)晶紫的MTT，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入200 μL二甲基亞砜充分振蕩后用酶標(biāo)儀(檢測波長490 nm，參考波長630 nm)讀取各孔吸光度(A)值，記錄結(jié)果。細(xì)胞生長抑制率=(對照孔A值-給藥孔A值)/對照孔A值×100%，同時計算半數(shù)毒性濃度(TC50)。

1.4艾葉乙酸乙酯提取物對HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg含量的影響選用對數(shù)生長期的HepG2.2.15細(xì)胞，胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，以 2×104mL-1接種于24孔板，每孔1 mL。24 h后待細(xì)胞貼于孔底，吸去舊的培養(yǎng)基，分別加入含0、10、20和40 mg/L艾葉乙酸乙酯提取物的RPMI 1640培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，并設(shè)100 mg/L拉米夫定為陽性對照。收集培養(yǎng)第3、6、9天的細(xì)胞上清液，于-20 ℃保存。用ELISA法測定上清液中HBsAg和HBeAg的含量，根據(jù)試劑盒的說明書操作。用酶標(biāo)儀讀數(shù)，選擇雙波長450/630 nm，讀取各孔OD值，取均值，計算抑制百分率和半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.5艾葉乙酸乙酯提取物對HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBVDNA拷貝數(shù)的影響用熒光定量PCR法測定。用DNA提取試劑盒提取1.4中培養(yǎng)第9天細(xì)胞上清液中的DNA，然后使用HBV核酸擴(kuò)增熒光定量檢測試劑盒進(jìn)行測定，均按照試劑盒說明書操作，計算抑制百分率和IC50。

1.6治療指數(shù)(TI) TI=TC50/IC50。TI<1.0表明受試樣品無效，1.0≤TI≤2.0為低效有毒即弱陽性，2.0

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1.6、8.0、40.0、200.0和500.0 mg/L的艾葉乙酸乙酯提取物作用后，細(xì)胞生長抑制率分別為10.07%、17.08%、24.69%、85.39%和90.48%，TC50為104.80 mg/L。

2.2艾葉乙酸乙酯提取物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg分泌的影響3個濃度的艾葉乙酸乙酯提取物對HBsAg和HBeAg均有抑制作用。艾葉乙酸乙酯提取物作用第9天對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg分泌的IC50分別為1.26和 8.06 mg/L，見表1。

表1 艾葉乙酸乙酯提取物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg分泌的抑制率 %

2.3艾葉乙酸乙酯提取物對HepG2.2.15細(xì)胞HBVDNA拷貝數(shù)的影響作用9 d后，拉米夫定對HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA的抑制率為94.15%。10、20和40 mg/L艾葉乙酸乙酯提取物對HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA的抑制率分別為5.31%、13.46%和54.19%，IC50為38.97 mg/L。

2.4TI艾葉乙酸乙酯提取物作用第9天的TI分別為HBsAg 83.2，HBeAg 13.0，HBV DNA 2.7。

3 討論

艾葉有護(hù)肝的作用，可降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶，恢復(fù)肝功能[8]，但抗HBV作用未見報道。HepG2.2.15細(xì)胞是當(dāng)前體外篩選抗HBV藥物和藥物評價較好的細(xì)胞模型，該模型是通過將重組HBV DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞而建立的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，能長期穩(wěn)定地分泌HBsAg、HBeAg和HBV，可表達(dá)HBV的全部標(biāo)志，被廣泛用于抗HBV藥物的體外研究[9-10]。作者以HepG2.2.15細(xì)胞株作為藥效評價模型，觀察了艾葉乙酸乙酯提取物對HBV的抑制作用，實(shí)驗(yàn)中選取拉米夫定作為陽性對照藥。拉米夫定是核苷類似物，臨床上廣泛應(yīng)用于抗HBV。在細(xì)胞內(nèi)，拉米夫定三磷酸鹽競爭性抑制HBV聚合酶，從而抑制前基因RNA反轉(zhuǎn)錄為負(fù)鏈DNA，阻斷新合成HBV DNA的鏈化，抑制HBV的復(fù)制，但在長期用藥過程中易產(chǎn)生耐藥性等問題。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明艾葉乙酸乙酯提取物對HBsAg和HBeAg的抑制作用較強(qiáng)，而對HBV DNA的抑制作用較弱，初步判斷其與拉米夫定作用機(jī)制不同。艾葉乙酸乙酯提取物可能作用于HBV的蛋白表達(dá)水平，而不在DNA的復(fù)制階段，不會出現(xiàn)耐藥性，如能研制成抗HBV新藥，將有助于解決抗HBV臨床用藥耐藥性的問題；對于艾葉乙酸乙酯提取物抗HBV的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

艾葉資源豐富，艾葉乙酸乙酯提取物提取工藝簡便、成本低，通過深入研究，將其研制成抗HBV新藥具有研究價值和應(yīng)用前景。

[1]李成偉,趙連榮,丁洋,等.聚乙二醇化干擾素-α-2a治療慢性乙型肝炎病毒動力學(xué)變化與療效關(guān)系研究[J]. 中國實(shí)用內(nèi)科雜志,2013,33(6):482

[2]顏幸杰. 中西醫(yī)結(jié)合治療慢性乙型肝炎的研究進(jìn)展[J]. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥, 2010, 29(18)：114

[3]陳成偉,陳從新,陳士俊,等. 核苷和核苷酸類藥物治療慢性乙型肝炎的耐藥及其管理[J]. 中國實(shí)用內(nèi)科雜志,2013,33(1):82

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部[M]. 2010版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:83

[5]周英棟, 費(fèi)新應(yīng). 艾葉的藥理作用研究[J]. 湖北中醫(yī)雜志, 2010,32(11):75

[6]蔡平. 艾葉的藥理作用及應(yīng)用[J].時珍國醫(yī)國藥, 2001, 12(2): 1137

[7]Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays [J]. J Immunol Methods, 1983, 65(1/2):55

[8]黃世泰, 周有恒. 肝舒注射液治療肝炎療效觀察[J].中成藥研究, 1979(3): 34

[9]許秀妮,趙昉,趙敬賢,等.觀辣樹水提物體外抗乙肝病毒的實(shí)驗(yàn)研究[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志,2012,22(7):514

[10]郭丹,陳娜娜,吳曙光，等. 環(huán)氧合酶2基因沉默誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的作用觀察[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2012,37(7):715