自發(fā)性高血壓大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和腦組織SK2蛋白的表達(dá)*

俞 悅 ，王 震，穆永慧，趙偉達(dá)，韓麗娟，張 展，章 茜，楊 春#

1)鄭州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室 鄭州 450001 3)河南大學(xué)生命科學(xué)院 開封 475004

高血壓病是危害人類健康的最主要疾病之一，可對人體心、腦等靶器官造成嚴(yán)重?fù)p害[1]。高血壓作為腦血管病的重要危險因素之一, 對認(rèn)知功能的影響已經(jīng)得到關(guān)注[2-3]。小電導(dǎo)鈣激活鉀通道(small conductance Ca2+-activated K+channels，SK channels)在腦組織中高表達(dá)[4]，參與神經(jīng)元動作電位后電位的形成[5]，被認(rèn)為與突觸可塑性以及學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)[6-7]。作者利用自發(fā)性高血壓(spontaneously hypertension，SH)大鼠，運用無創(chuàng)實驗方法，探討自發(fā)性高血壓對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦組織SK2蛋白表達(dá)的影響，為深入研究自發(fā)性高血壓對認(rèn)知功能的影響及其相關(guān)分子機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組SH大鼠和對照Wistar-Kyoto(WKY) 大鼠各7只，7～8月齡，體質(zhì)量200～300 g,均購自北京維通利華公司。

1.2鼠尾動脈壓的測量將大鼠置于固定盒中，將尾套置于鼠尾根部，脈搏傳感器傳感片緊貼鼠尾下方，然后將鼠尾及尾套預(yù)熱，同時等待大鼠安靜，待脈搏穩(wěn)定之后，使用球囊打氣加壓直至脈搏波呈直線，緩慢放氣，待脈搏波動出現(xiàn)時，此時測量的尾套內(nèi)氣體壓力即鼠尾動脈壓。

1.3心電圖測量大鼠經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛麻醉(3 mL/kg)后固定于鼠板上，將針形電極刺入四肢皮下，采用Rm6240型多道生理信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)連續(xù)記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖1 h，測量P波時長、P-R間期、QRS時長、R-R間期。

1.4大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的測試

1.4.1 Y型迷宮實驗[8]Y型迷宮(張家港生物醫(yī)學(xué)儀器廠)由3只短臂組成，以大鼠所在短臂為起步區(qū)，另兩只短臂中隨機選擇一只為安全區(qū)，一只為非安全區(qū)。安全區(qū)燈泡開亮，銅柵無電流。起步區(qū)和非安全區(qū)燈泡不亮，銅柵有電流(約40 V)。控制開關(guān)打開后，安全區(qū)燈光立刻亮起，起步區(qū)和非安全區(qū)延遲2 s后通電。若大鼠在燈光亮起時能成功逃向安全區(qū)，則記為“正確”，否則記為“錯誤”；5 s后進(jìn)行第2次操作。若連續(xù)10次中有9次正確，則視為“學(xué)會”，這10次操作之前的操作次數(shù)記為“學(xué)會次數(shù)”；若100次后仍未學(xué)會，則“學(xué)會次數(shù)”記為100。24 h后，重復(fù)此操作，若連續(xù)10次中有9次正確，則視為“記住”，這10次操作之前的操作次數(shù)記為“記憶次數(shù)”；若100次后仍未學(xué)會，則“記憶次數(shù)”記為100。

1.4.2 跳臺實驗 自制30 cm×30 cm×30 cm被動回避反應(yīng)箱，四周用塑料板分隔，箱底為可通電的銅柵，箱底中間置一7 cm×7 cm×7 cm的絕緣泡沫正方體，作為小鼠回避電擊的安全臺，由一可調(diào)變壓器調(diào)節(jié)電壓，提供交流電。實驗前將大鼠放在銅柵上，適應(yīng)3 min，然后將大鼠放上平臺，等大鼠跳下后再將其放回平臺上，如此重復(fù)5次；然后給予持續(xù)電刺激(約40 V)，大鼠受刺激后會自動跳上平臺，如此反復(fù)訓(xùn)練，直至大鼠在平臺上一次持續(xù)停留時間超過5 min，視為“學(xué)會”。記錄此過程中的“上臺次數(shù)”和受電擊總時間“Ta”。當(dāng)20 min內(nèi)仍未學(xué)會時，若上臺次數(shù)大于該組中學(xué)會者的最高上臺次數(shù)，則記為其“上臺次數(shù)”，否則以該組學(xué)會者的最高上臺次數(shù)作為其“上臺次數(shù)”。24 h后，將大鼠置于跳臺上，通電，記錄5 min內(nèi)的“下臺次數(shù)”和受電擊總時間“Tb”。

1.5大鼠腦組織SK2蛋白的檢測迷宮和跳臺實驗結(jié)束后,大鼠經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛麻醉(3 mL/kg)后迅速斷頭取腦，-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆?。冰下從腦組織中提取蛋白，采用Western blot法檢測SK2蛋白。提取的蛋白樣品加入5×loading buffer，99 ℃煮沸5 min，100 g/L SDS-PAGE分離膠上樣后100 V電泳3 h；取下凝膠，4 ℃恒壓(100 V)電轉(zhuǎn)2 h。取下PVDF膜(Bio-Rad公司)，50 g/L 脫脂牛奶-TBS室溫封閉1 h，隨即加入兔多克隆抗SK2抗體(按1150稀釋，Sigma公司)4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗膜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(按15 000稀釋，Thermo公司)室溫孵育2 h，TBST漂洗，ECL化學(xué)發(fā)光曝光顯影。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SAS 9.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。2組大鼠鼠尾動脈壓、心電圖參數(shù)、學(xué)習(xí)次數(shù)和記憶次數(shù)、上下臺次數(shù)及Ta、Tb的比較均采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠血壓和心電圖指標(biāo)的比較見表1。

2.2 2組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測試結(jié)果Y型迷宮實驗結(jié)果見表2，跳臺實驗結(jié)果見表3。

表1 2組大鼠血壓和心電圖指標(biāo)的比較

1 mmHg=0.133 kPa。

表2 Y型迷宮實驗結(jié)果

表3 跳臺實驗結(jié)果

2.3 2組大鼠腦組織SK2蛋白的表達(dá)見圖1。SH組大鼠腦組織SK2蛋白表達(dá)高于對照組。

圖1 2組大鼠腦組織SK2蛋白的表達(dá)

3 討論

SH大鼠是用Wistar-Kyoto大鼠培育而成，出生后3個月內(nèi)便能發(fā)展成為穩(wěn)定的高血壓;其發(fā)病機制、心血管并發(fā)癥、外周血管阻力變化等都與人類高血壓病相似,是目前公認(rèn)的最接近于人類原發(fā)性高血壓的動物模型[9]。該實驗選用的SH大鼠血壓較對照組大鼠明顯升高，說明該模型大鼠符合高血壓模型條件。同時心電圖測量結(jié)果顯示SH大鼠QRS時長和R-R間期延長，提示其可能有心室肥厚和緩慢性心律失常，說明高血壓已經(jīng)對該模型大鼠心臟造成損傷，這與人類高血壓患者的心功能表現(xiàn)相似[10]。

認(rèn)知指人體對外界事物的認(rèn)識辨析能力, 是大腦高級中樞的重要功能之一。臨床研究以及流行病學(xué)調(diào)查顯示,長期高血壓對個體的認(rèn)知功能有一定程度的損傷。該研究采用Y型迷宮實驗中大鼠正確反應(yīng)前所需的電擊次數(shù)、跳臺實驗中大鼠正確反應(yīng)前上下臺次數(shù)和受電擊時間，表示其空間辨別能力和逃避條件反射能力[7]。結(jié)果證實了SH大鼠學(xué)習(xí)能力較對照組大鼠明顯減退。此結(jié)果與Stocker等[5]報道的SH大鼠在諸如條件性回避反射和空間辨別等學(xué)習(xí)記憶能力降低相一致[11]。

近年來，一些研究表明，SK通道與海馬學(xué)習(xí)記憶及突觸可塑性有關(guān),SK通道蛋白表達(dá)異常可導(dǎo)致動物認(rèn)知功能障礙。Hammond等[12]研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，SK2蛋白過表達(dá)的小鼠高頻刺激后的長時程增強效應(yīng)減弱，海馬相關(guān)的記憶功能嚴(yán)重受損。Vick等[13]發(fā)現(xiàn)，SK通道的過表達(dá)可影響記憶編碼，損害記憶。另一方面，Ballesteros-Merino等[14]研究發(fā)現(xiàn)，SK通道阻滯劑蜜蜂神經(jīng)毒素能夠選擇性阻斷SK通道，增加在海馬信息加工處理中發(fā)揮重要作用的CA1錐體神經(jīng)元的興奮性突觸后電位數(shù)量，從而異化學(xué)習(xí)記憶能力。Liegeois等[15]的研究顯示，荷包牡丹堿能夠有效地抑制SK通道引起的神經(jīng)元后超極化，抑制神經(jīng)元細(xì)胞興奮性的減低，從而增強相關(guān)學(xué)習(xí)記憶能力。該研究發(fā)現(xiàn)SH大鼠腦組織SK2蛋白表達(dá)較對照大鼠增強，提示SK通道可能參與了高血壓大鼠認(rèn)知損害的過程，但是其作用的分子機制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，自發(fā)性高血壓可引起心臟功能異常，學(xué)習(xí)記憶能力減退， 而SK通道在學(xué)習(xí)記憶能力損害的過程中可能發(fā)揮重要作用。該研究為深入探討自發(fā)性高血壓對認(rèn)知功能的影響及相關(guān)分子機制提供了實驗依據(jù)。

[1]趙雅寧，李建民，劉樂，等.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78在高血壓加重全腦缺血大鼠神經(jīng)損傷中的作用[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，32(11)：1675

[2]Vasilopoulos T, Kremen WS, Kim K, et al. Untreated hypertension decreases heritability of cognition in late middle age[J]. Behav Genet,2012,42(1):107

[3]Púzserová A, Kopincová J, Bernátová I. Endothelial (dys) function in the experimental model of primary hypertension[J]. Cesk Fysiol,2010,59(1):4

[4]Kohler M, Hirschberg B, Bond CT, et al. Small conductance, calcium-activated potassium channels from mammalian brain[J]. Science,1996,273(5282):1709

[5]Stocker M. Ca2+-activated K+channels: molecular determinants and function of the SK family[J]. Nat Rev Neurosci, 2004, 5(10):758

[6]Bond CT, Maylie J, Adelman JP. SK channels in excitability, pacemaking and synaptic integration[J]. Curr Opin Neurobiol, 2005,15(3):305

[7]Ohtsuki G, Piochon C, Adelman JP, et al. SK2 channel modulation contributes to compartment-specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells[J]. Neuron, 2012,75(1):108

[8]Jiwa NS, Garrard P, Hainsworth AH. Experimental models of vascular dementia and vascular cognitive impairment: a systematic review[J]. J Neurochem, 2010 ,115(4):814

[9]田心,王蓓,王長海,等. 以自發(fā)性高血壓大鼠為模型對高血壓發(fā)病機制的研究[J]. 華中醫(yī)學(xué)雜志,2009,33(2):112

[10]孫剛.高血壓左心室肥厚臨床危害及治療對策[J]. 中國實用內(nèi)科雜志，2011，31(8)：598

[11]Sánchez F, Gómez-Villalobos Mde J, Juarez I,et al. Dendritic morphology of neurons in medial prefrontal cortex, hippocampus, and nucleus accumbens in adult SH rats[J]. Synapse,2011,65(3):198

[12]Hammond RS, Bond CT, Strassmaier T, et al. Small-conductance Ca2+-activated K+channel type 2 (SK2) modulates hippocampal learning, memory, and synaptic plasticity[J]. J Neurosci,2006, 26(6):1844

[13]Vick KA 4th, Guidi M, Stackman RW Jr. In vivo pharmacological manipulation of small conductance Ca2+-activated K+channels influences motor behavior, object memory and fear conditioning[J]. Neuropharmacology,2010,58(3):650

[14]Ballesteros-Merino C, Lin M, Wu WW, et al. Developmental profile of SK2 channel expression and function in CA1 neurons[J]. Hippocampus,2012,22(6):1467

[15]Liegeois JF, Mercier F, Graulich A, et al. Modulation of small conductance calcium-activated potassium(SK) channels: a new challenge in medicinal chemistry[J]. Curr Med Chem,2003,10(8):625