抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞TWIST基因表達(dá)對細(xì)胞侵襲能力的影響

喬澤強(qiáng)

南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院普外一科 南陽 473058

肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移使其臨床進(jìn)展迅速且預(yù)后較差，病死率高。研究肝癌細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移的影響因素并闡明其機(jī)制，對于提高患者的生存率至關(guān)重要。已有研究[1-3]表明TWIST在乳癌、胃癌、結(jié)腸癌等組織中高表達(dá)且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。作者設(shè)計合成了靶向TWIST基因的小干擾RNA，轉(zhuǎn)染入人肝癌SMMC-7721 細(xì)胞，采用RT-PCR和Western blot分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞TWIST mRNA和蛋白表達(dá)水平，并觀察體外侵襲能力的變化。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑人肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞株購自上海細(xì)胞生物研究所； 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，TWIST兔抗人多克隆抗體、E-cadherin兔抗人多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，cDNA第一鏈合成試劑盒及PCR擴(kuò)增試劑盒(上海生工生物工程服務(wù)有限公司)，Boyden小室(鄭州金賽爾生物科技有限公司)，Matrigal膠(BD公司)。引物由北京賽百盛生物工程公司合成。

1.2靶向TWIST基因siRNA的合成根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及查GenBank中TWIST基因(NM_000474.3)的序列，合成靶向TWIST的siRNA序列: 5’-UG GAUUUGUACCAUUCUUCUG-3’。用Blast對選中的特異性siRNA序列和無關(guān)序列進(jìn)行同源性分析。同時設(shè)計陰性對照siRNA，其堿基序列隨機(jī)排列，與人類基因的外顯子無同源性。

1.3細(xì)胞分組SMMC-7721細(xì)胞在含100 g/L胎牛血清，1×105U/L 青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板，每孔 2×105個，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)50%，參照LipofectamineTM2000說明書轉(zhuǎn)染。實(shí)驗分為3組：空白對照組(未轉(zhuǎn)染)，陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA)，TWIST siRNA組(轉(zhuǎn)染靶向TWIST的siRNA)，濃度均為50 nmol/L。培養(yǎng)6 h后，轉(zhuǎn)為全培液培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收獲細(xì)胞，進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.4TWIST和E-cadherinmRNA的檢測采用半定量RT-PCR 方法。Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，電泳鑒定其完整性，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，PCR擴(kuò)增TWIST和E-cadherin基因。TWIST引物上游序列：5’-TGGTCCATGTCCGCGTCCCA-3’，下游序列：5’-CGCCCCACGCCCTGTTTCTTT-3’，產(chǎn)物大小為207 bp；E-cadherin引物上游序列：5’-TGATTCTGCT GCTCTTGCTGTT-3’，下游序列：5’-CAAAGTCCTG GTCCTCTTCTCC-3’，產(chǎn)物大小為128 bp；內(nèi)參β-actin引物上游序列：5’-GGGAAATCGTGCGTGACA-3’，下游序列：5’-TCAGGAGGAGCAATGATC-3’，產(chǎn)物大小為385 bp。使用SYNGENE凝膠分析系統(tǒng)軟件掃描，以目的基因條帶與內(nèi)參基因條帶灰度值的比值作為目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

1.5TWIST和E-cadherin蛋白的表達(dá)檢測采用Western blot方法。提取各組細(xì)胞總蛋白，用考馬斯亮藍(lán)G250結(jié)合法測定蛋白質(zhì)濃度。各組樣品分別取總蛋白300 μg，經(jīng)100 g/L SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜。與特異性一抗37 ℃溫育2 h，4 ℃過夜。與二抗室溫孵育2 h后，ECL化學(xué)發(fā)光劑于暗室中曝光和顯影。測定目的條帶的光密度值，以其表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.6細(xì)胞體外侵襲力采用Boyden小室檢測。小室上、下室之間用孔徑8 μm的聚碳酸酯膜分開，膜上鋪人工基底膜Matrigal 120 μL/室，下室加200 μL趨化因子，上室內(nèi)滴入單細(xì)胞懸液(5×105L-1)400 μL/室，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。取出小室，黏附到濾膜下室面的細(xì)胞用甲醛固定，常規(guī)HE染色，400倍顯微鏡下隨機(jī)計數(shù)5個視野穿膜細(xì)胞數(shù)。每組設(shè)3個平行樣本，重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各組細(xì)胞TWIST、E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)，以及穿膜細(xì)胞數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組細(xì)胞TWIST和E-cadherinmRNA的表達(dá)見圖1、表1。

圖1 各組細(xì)胞TWIST(上)和E-cadherin(下) mRNA的表達(dá)

2.2各組細(xì)胞TWIST和E-cadherin蛋白的表達(dá)

見圖2、表1。

2.3各組細(xì)胞體外侵襲能力的比較見表1。

圖2 各組細(xì)胞TWIST(上)和E-cadherin(下) 蛋白的表達(dá)

表1 各組細(xì)胞TWIST、E-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)以及穿膜細(xì)胞數(shù)比較

*與空白和陰性對照組比較，P<0.05。

3 討論

腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的過程涉及多種基因的表達(dá)異常，TWIST基因在其中的作用越來越受到重視[4]。TWIST是一種編碼位于常染色體上的堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子。TWIST基因最早于1983年在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，隨后在多種生物及人體中也相繼發(fā)現(xiàn)了該基因的相似結(jié)構(gòu)。TWIST核苷酸高度保守，在小鼠和人類的氨基酸序列具有96%的同源性，并且在不同的種屬中其DNA結(jié)合區(qū)域具有100%的序列保守[5]。Liu等[6]利用RNAi技術(shù)沉默MKN45細(xì)胞中TWIST基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MKN45細(xì)胞體外侵襲能力明顯下降；Gong等[7]研究發(fā)現(xiàn)在食管癌EC9706細(xì)胞中抑制TWIST基因的表達(dá)同樣可以抑制該細(xì)胞的體外侵襲能力。但有關(guān)TWIST基因在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究較少。該研究結(jié)果表明，TWIST基因mRNA和蛋白的表達(dá)在TWIST siRNA組明顯低于空白和陰性對照組，TWIST siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)較空白和陰性對照組明顯減少， 提示沉默TWIST基因能有效降低SMMC-7721 細(xì)胞體外侵襲能力。

惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的多步驟過程，但上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)在其中的起始作用越來越受到國內(nèi)外學(xué)者重視[8]?？缒さ鞍譋-cadherin是上皮表型的重要標(biāo)志，它的表達(dá)降低是導(dǎo)致EMT發(fā)生至關(guān)重要的一步[9]。作者的研究結(jié)果顯示，TWIST siRNA組E-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)較空白和陰性對照組升高。因此推測TWIST可能作為E-cadherin的重要轉(zhuǎn)錄抑制因子，通過參與EMT的發(fā)生在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞TWIST基因表達(dá)可能進(jìn)一步抑制肝癌細(xì)胞EMT的發(fā)生，同時可有效降低肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。下一步作者將進(jìn)一步實(shí)驗印證TWIST和E-cadherin在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，以期為肝癌的基因治療提供一定的理論基礎(chǔ)和可能的治療靶點(diǎn)。

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