脂肪來源干細(xì)胞復(fù)合不同生物支架在裸鼠皮下的促血管化作用

徐永飛，張建文，暴志國，李靜怡，王耀聰，許穎溦

鄭州大學(xué)第一附屬院整形外科 鄭州 450052

自體脂肪移植是理想的修復(fù)軟組織缺損的方法，但移植的脂肪組織成活率低，限制了其在臨床上的推廣及應(yīng)用[1-2]。但大多數(shù)組織工程以固態(tài)支架為主，不能適應(yīng)微創(chuàng)醫(yī)學(xué)美容整形的發(fā)展。自體脂肪移植應(yīng)用于美容外科具有很多優(yōu)點,可代替其他生物制品進行凹陷填充或去除輕微的皺紋,而無過敏或排異反應(yīng),減少并發(fā)癥的出現(xiàn)[3]。細(xì)胞支架材料可以選擇脂肪抽吸中的脂肪顆粒和可降解的注射充填材料(透明質(zhì)酸鈉、膠原等),種子細(xì)胞可以選擇人體容易獲得的脂肪來源干細(xì)胞。作者將種子細(xì)胞和細(xì)胞支架混合,形成細(xì)胞-支架復(fù)合物,以此探討這種材料作為脂肪組織工程載體材料的可行性。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1 實驗試劑 Ⅱ型膠原酶(Gibco公司，美國)，胎牛血清[賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司]，DMEM培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶(北京Solarbio公司)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(北京雙路藥業(yè))。

1.1.2 主要儀器 組織勻漿機、純水系統(tǒng)、恒溫CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific，上海)、低溫臺式離心機(Eppendorf，德國)、超凈工作臺(VL-4S，珠海市再鑫儀器有限公司)。

1.1.3 支架材料 脂肪組織來源于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012年8月臨床吸脂患者抽取組織?；颊撸?，23歲，身體健康，抽取雙下肢股外側(cè)及股后側(cè)脂肪組織100 mL。透明質(zhì)酸鈉、Ⅰ型膠原支架(Sigma公司，美國)。

1.1.4 實驗動物 裸鼠12只，4周齡,體質(zhì)量15～30(20.3±2.3) g，雄性，由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院重點實驗室提供，所有動物均在無菌環(huán)境下用標(biāo)準(zhǔn)飼料進行飼養(yǎng)。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2脂肪來源干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)膠原酶消化脂肪組織，分離收集原代脂肪來源干細(xì)胞，按4×105mL-1接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入低糖DMEM+體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng),收集第3代細(xì)胞作為種子細(xì)胞，DⅡ熒光標(biāo)記[4]。

1.3脂肪來源干細(xì)胞-生物支架復(fù)合物制備、植入和取材實驗分為4組，A組為脂肪顆粒，B組為透明質(zhì)酸鈉，C組為Ⅰ型膠原支架，分別與25×106mL-1的脂肪來源干細(xì)胞按照體積比11混合，D組為單純脂肪來源干細(xì)胞，每一樣本于裸鼠背部皮下注射0.2 mL,每只裸鼠各注射4個點。3個月后處死動物，分別沿每只裸鼠4個注射點縱向切開皮膚，沿移植物被膜外分離，完整取出移植物，測量體積。

1.4新生組織塊濕質(zhì)量、存活率及微血管密度測定

濕質(zhì)量：沿移植物被膜外分離，完整取出移植物，立即以電子天平稱濕質(zhì)量。存活率:存活率=術(shù)后復(fù)合組織塊體積/術(shù)前復(fù)合組織塊體積(0.2 mL)×100%。微血管密度：組織塊進行HE染色和免疫組化染色,采用小鼠抗兔CD31抗體作為一抗，按照免疫組化SP試劑盒操作步驟進行染色，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，染成棕色或棕黃色的單個細(xì)胞或細(xì)胞叢即為血管，用XSZ-81型光學(xué)顯微鏡觀察，在切片中選擇10個視野(×200)，計數(shù)每個視野中微血管數(shù)，取其平均值。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0進行分析，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析比較4組間濕質(zhì)量、存活率及微血管密度的差異，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1大體觀察取材時，裸鼠背部均無脂肪組織，界限清晰，包膜完整，易分離，脂肪組織形狀不規(guī)則，大小不一。A、B、C組組織塊明顯大于D組。見圖1。

圖1 術(shù)后各組新生組織塊大體觀察結(jié)果

2.2濕質(zhì)量、存活率、微血管密度比較A、B、C組濕質(zhì)量、存活率、微血管密度均高于D組。見表1。

表1 各組新生組織塊濕質(zhì)量、存活率、微血管密度比較(n=12)

*：與其他3組比較，P均<0.05。

2.3新生組織塊HE及免疫組化染色與D組比較，A、B、C組脂肪結(jié)構(gòu)保持較完整，且血管結(jié)構(gòu)典型、數(shù)量較多。見圖2。

3 討論

近年來隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用組織工程技術(shù)研究可注射性軟組織充填物是一個新的發(fā)展方向，其中理想的種子細(xì)胞來源及生物支架的構(gòu)建是工程化研究成功的關(guān)鍵。

圖2 各組新生組織塊HE及免疫組化染色結(jié)果(×200)

脂肪來源干細(xì)胞為從脂肪組織中分離出來的具有多分化潛能的成體干細(xì)胞，在體外可以誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞等，更重要的是其還可以分泌多種促血管化的細(xì)胞因子，促進移植物的血管化，提高存活率。脂肪來源干細(xì)胞已在組織修復(fù)及美容外科中發(fā)揮了巨大的作用，是組織工程中較常用的種子細(xì)胞[5]。

脂肪顆粒、透明質(zhì)酸鈉和膠原等可作為生物支架并與脂肪來源干細(xì)胞具有一定的協(xié)同作用。其中脂肪顆粒來自于自身組織，無明顯排異反應(yīng)，可為種子細(xì)胞提供很好的微環(huán)境和生物支架。研究證實脂肪來源干細(xì)胞在向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化的同時也可向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化[6-8]，并分泌EGF、FGF等生長因子[9]，改善局部血液循環(huán)，促進局部細(xì)胞增生分裂，從而減少細(xì)胞缺血時間、降低細(xì)胞液化吸收率，使脂肪來源干細(xì)胞和脂肪顆粒具有一定的協(xié)同作用。非動物源性的透明質(zhì)酸鈉是一種天然的高分子多糖，是世界上公認(rèn)的保濕劑，很容易發(fā)生降解。透明質(zhì)酸具有非抗原性，很少引起炎癥和異物反應(yīng)。因其無致敏性、容易獲得且本身就是細(xì)胞基質(zhì)成分,作為組織工程支架具有廣闊的前景。膠原是屬于細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，廣泛存在于脊椎動物和人的皮膚、肌腱、韌帶、軟骨及骨等組織或器官中，其主要成分是糖蛋白，約占機體總蛋白的25%。膠原具有很好的生物學(xué)性能，是目前組織工程研究中最常用的天然生物支架材料[10]。因此作者選擇這3種材料作為該研究的細(xì)胞支架材料[11-14]。

作者發(fā)現(xiàn)，與無支架的單純脂肪來源干細(xì)胞相比，脂肪來源干細(xì)胞-生物支架復(fù)合物在裸鼠軟組織中血管化作用比較明顯，且3種支架的促血管化作用無差異。該結(jié)果證明了這3種材料作為組織工程中生物支架的可行性，為臨床脂肪來源干細(xì)胞移植中生物支架的選擇提供了理論依據(jù)。

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