非小細(xì)胞肺癌組織中Nanog的表達(dá)*

駱梅青，卜 慶，曹軼林，鄭桂銀，伍愛(ài)華

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 桂林 541001

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居全球首位。目前最新理論[1]認(rèn)為腫瘤是一種干細(xì)胞疾病，惡性腫瘤中存有數(shù)量極少的腫瘤干細(xì)胞，在腫瘤的形成和生長(zhǎng)中起著決定性作用，這些腫瘤干細(xì)胞具有無(wú)限增殖、自我更新及分化的能力，并表達(dá)相似的分子標(biāo)記和基因產(chǎn)物。 Nanog在2003年由Chambers等[2]報(bào)道,為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物，在維持細(xì)胞自我更新和保持全能性中發(fā)揮重要作用，可促進(jìn)腫瘤的增生、侵襲和轉(zhuǎn)移，目前在乳癌、肝癌、前列腺癌及結(jié)腸癌等惡性腫瘤中都有報(bào)道[3-4]。作者通過(guò)免疫組化方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)了NSCLC組織中Nanog的表達(dá)，并進(jìn)一步探討Nanog的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2005年1月至2007年3月手術(shù)切除或經(jīng)頸胸腔鏡活檢的NSCLC標(biāo)本106例，男81例，女25例?；颊吣挲g35～75歲,中位年齡50歲。106例中鱗狀細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱鱗癌)57例,腺癌49例，均經(jīng)病理明確診斷。病理分級(jí)：Ⅰ級(jí)39例，Ⅱ級(jí)34例，Ⅲ級(jí)33例。T分期：T1～261例，T3～445例；N分期：N059例，N1～347例。另取10例正常肺組織標(biāo)本(為明確診斷而行CT下肺穿刺或纖支鏡檢查，病理診斷為正常肺組織)作對(duì)照。標(biāo)本一部分液氮保存，另一部分石蠟包埋切片。所有患者術(shù)前均未做化療、放療, 有完整的臨床和隨訪資料；隨訪至2012年9月，生存期為確診之日至死亡或末次隨訪時(shí)間。

1.2主要試劑鼠抗人Nanog單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signal公司,SP法免疫組化試劑盒及DAB顯色劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。Trizol購(gòu)自Invitrogen公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國(guó)Ferments公司產(chǎn)品,SYBR Green PCR為 TaKaRa公司產(chǎn)品，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品。其他常規(guī)分子生物學(xué)試劑均購(gòu)自Sigma公司。

1.3NSCLC和正常肺組織中Nanog蛋白的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照免疫組化SP試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后，體積分?jǐn)?shù)3%過(guò)氧化氫溶液室溫下孵育15 min，高壓抗原修復(fù)2 min后冷卻至室溫，滴加山羊血清,室溫下孵育10 min,棄血清,滴加一抗工作液(按1100稀釋),4 ℃冰箱過(guò)夜，滴加生物素標(biāo)記的二抗,37 ℃孵育10 min，DAB顯色，自來(lái)水反復(fù)沖洗，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水,二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。用 PBST代替一抗作陰性對(duì)照。SP染色陽(yáng)性反應(yīng)物呈棕黃色。采用半定量積分法判定結(jié)果, 每張切片選5個(gè)高倍視野,計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,陽(yáng)性細(xì)胞百分比≤5%為0分,～25%為1分,～50%為2分,～75%為3分,>75%為4分;根據(jù)免疫陽(yáng)性細(xì)胞染色程度,黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。兩項(xiàng)積分相乘,0～1分為陰性，≥2分為陽(yáng)性[5]。

1.4NSCLC和正常肺組織中NanogmRNA的測(cè)定取10～15 mg液氮保存的組織標(biāo)本，Trizol提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)體系為20 μL，Nanog上游引物：5’-CAGAAGGCCTCAGCACCTAC-3’,下游引物：5’-ATTGTTCCAGGTCTGGTTGC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為111 bp。內(nèi)參β-actin上游引物：5’-CCAACCGCGAGAAGATGA-3’，下游引物5’-CCA GAGGCGTACAGGGATAG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為152 bp。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，45個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自動(dòng)生成Ct并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及融解曲線。所生成的Ct值取均值后代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出目的基因的表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)。采用確切概率法比較NSCLC和正常肺組織中Nanog蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的差異,χ2檢驗(yàn)比較不同人口學(xué)特征和臨床病理特征的NSCLC患者Nanog蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的差異。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析。采用單因素方差分析比較NSCLC和正常肺組織及不同病理級(jí)別的NSCLC組織中Nanog mRNA表達(dá)量的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1不同組織中Nanog蛋白的表達(dá)Nanog蛋白陽(yáng)性染色為棕黃色顆粒, 主要分布于NSCLC細(xì)胞胞核中，見(jiàn)圖1。NSCLC組織中Nanog蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為24.5%(26/106)，而在正常組織中未見(jiàn)表達(dá)，2者相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.114)。

圖1 正常肺組織(A)、肺鱗癌組織(B)和肺腺癌組織(C)中Nanog蛋白的表達(dá)(SP，×400)

2.2Nanog蛋白的表達(dá)與NSCLC患者一般人口學(xué)特征及臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3Nanog蛋白的表達(dá)與NSCLC預(yù)后的關(guān)系生存曲線見(jiàn)圖2、3。肺鱗癌患者中Nanog蛋白陰性表達(dá)者及陽(yáng)性表達(dá)者的M(T25，T75) 分別為36(20，60)和32(16，36)個(gè)月，Nanog蛋白的表達(dá)與肺鱗癌患者的預(yù)后無(wú)關(guān)(χ2=0.013，P=0.917)，但肺腺癌患者中Nanog蛋白陰性表達(dá)者及陽(yáng)性表達(dá)者的M(T25，T75) 分別為48(36，56)和33(14，57)個(gè)月，Nanog陰性表達(dá)者預(yù)后較好(χ2=5.352，P=0.020)。

表1 Nanog蛋白的表達(dá)與NSCLC患者一般人口學(xué)特征及臨床病理特征的關(guān)系

圖2 Nanog蛋白的表達(dá)與肺鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系

圖3 Nanog蛋白的表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.4不同組織中NanogmRNA的表達(dá)Nanog mRNA在正常肺組織中的表達(dá)量(0.277±0.190)明顯低于NSCLC組織(0.950±0.183)，2者相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=122.662，P<0.001)；Nanog mRNA在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)NSCLC組織中的表達(dá)量分別為(0.831±0.194)、(0.905±0.144)和(1.076±0.123)，3者相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.047,P=0.020)。

3 討論

目前腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞由數(shù)量較少的腫瘤干細(xì)胞和大多數(shù)表型不同的腫瘤分化細(xì)胞組成[6]。腫瘤干細(xì)胞數(shù)量較少但難以清除的特點(diǎn)是導(dǎo)致腫瘤治療效果差、生存期短的主要原因[7]。Nanog基因是胚胎發(fā)育早期的轉(zhuǎn)錄因子之一，在胚胎發(fā)育過(guò)程中維持正常的組織分化和個(gè)體發(fā)育；Nanog基因也是體外誘導(dǎo)iPS的主要基因之一，為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物。基于這種觀點(diǎn)，檢測(cè)調(diào)控腫瘤干細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵基因Nanog的表達(dá)在腫瘤研究中具有重要意義[8]。目前研究[9]表明，Nanog除了能在生殖細(xì)胞系及生殖細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)外，在肺癌組織中也有表達(dá)。

該研究結(jié)果表明，Nanog蛋白在NSCLC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常肺組織，提示Nanog蛋白的表達(dá)可能與NSCLC的發(fā)生有關(guān)。此外，Nanog蛋白的表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)類型有關(guān)，在腺癌中的表達(dá)明顯高于鱗癌，與文獻(xiàn)[10]的研究結(jié)果一致。同時(shí)，該研究結(jié)果還顯示，Nanog蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率隨著病理級(jí)別的增高有升高的趨勢(shì)，提示Nanog蛋白的表達(dá)可能與NSCLC的惡性程度有關(guān)。另有文獻(xiàn)[11]報(bào)道，在腎細(xì)胞癌中Nanog為抑癌因素，提示在不同類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，即使是同一種基因也會(huì)發(fā)揮不同的作用。

該研究結(jié)果還顯示，與正常肺組織相比，Nanog mRNA在NSCLC組織中高表達(dá)，并且隨病理級(jí)別的增高有升高的趨勢(shì)。有些學(xué)者[12]認(rèn)為其原因可能為導(dǎo)致間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的發(fā)生，但闡明其具體機(jī)制還需相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。體外實(shí)驗(yàn)[13-14]表明，干細(xì)胞標(biāo)記物會(huì)隨著干細(xì)胞分化程度的增高而減少，這與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物與肺癌組織的不同分化程度有關(guān)相一致。

此外，該研究結(jié)果還顯示，Nanog蛋白的表達(dá)與肺鱗癌的預(yù)后無(wú)關(guān)，但與肺腺癌的預(yù)后有關(guān)，Nanog蛋白陰性表達(dá)者預(yù)后較好。曾有報(bào)道[16]發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞相關(guān)因子主要在肺腺癌中表達(dá)，但從 Nanog角度國(guó)內(nèi)外尚未有相關(guān)報(bào)道。

綜上所述，Nanog蛋白和mRNA在NSCLC組織中高表達(dá)，可能與NSCLC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)；Nanog蛋白的表達(dá)與肺腺癌的預(yù)后有關(guān)。該研究結(jié)果可能為分析NSCLC的生物學(xué)行為、進(jìn)一步開(kāi)展新的基因治療提供幫助。

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